포유류 스트레스 과립을 특성화하고 정량화하기 위한 면역형광 분석

커버슬립에 부착된 골육종 세포가 포함된 멀티웰 플레이트를 가져 와서 복용하십시오.

이러한 골암 세포는 스트레스 유발 화학 물질로 전처리되어 스트레스 과립이 형성됩니다.

스트레스 과립은 비번역 mRNA, 작은 리보솜 서브유닛, RNA 결합 단백질 또는 RBP, 번역 관련 인자 및 신호 전달 단백질을 포함하는 세포질 막이 없는 소기관입니다.

배지를 버리고 버퍼로 세포를 세척합니다. 세포 형태를 보존하기 위해 세포를 고정합니다.

세포를 투과시켜 세포내 표적에 접근합니다. 비특이적 항체 결합을 방지하기 위해 차단 단백질을 추가합니다.

스트레스 과립 내에서 특정 RBP 및 번역 관련 인자에 결합하는 1차 항체를 도입합니다.

다른 형광단 표지 2차 항체 및 Hoechst 염료와 함께 배양합니다.

2차 항체는 스트레스 과립 관련 단백질에 결합된 1차 항체에 결합하는 반면, Hoechst 분자는 DNA를 염색합니다.

마운팅 매체를 사용하여 셀 함유 커버슬립을 장착합니다.

형광 현미경을 사용하여 세포를 관찰하여 관련 단백질의 공동 국소화를 특징으로 하는 형광 초점으로 나타나는 스트레스 과립을 시각화하고 정량화합니다.

세포를 고정하려면 웰에서 배지를 제거하고 약 250마이크로리터의 PBS로 세포를 세척합니다. 약 250마이크로리터의 완충된 4% 파라포름알데히드 용액을 첨가하여 세포를 고정하고 커버슬립의 상단이 완전히 덮여 있는지 확인합니다. 그런 다음 접시를 실온의 벤치 로커에 15분 동안 그대로 둡니다. 다음으로 파라포름알데히드를 제거하고 적절하게 폐기합니다.

약 250마이크로리터의 얼음처럼 차가운 메탄올을 첨가하여 세포를 투과화하고 평평하게 만듭니다. 로커에서 실온에서 플레이트를 추가로 5분 동안 배양합니다. 투과화가 완료되면 메탄올을 버리고 실온에서 1시간 동안 약 250마이크로리터의 차단 완충액을 적용하여 세포를 차단합니다. 그런 다음 G3BP1, eIF4G 및 eIF3b에 대한 항체 12마이크로리터를 3밀리리터의 차단 완충액에 첨가하여 1차 항체 용액을 준비합니다.

250웰 플레이트의 각 웰에 24마이크로리터의 항체 용액을 첨가합니다. 실온에서 최소 1시간 동안 로커에서 플레이트를 배양합니다. 배양 1시간 후, 항체 용액을 제거하고 약 250마이크로리터의 PBS로 세포를 5분 동안 세척합니다. 다음으로, 12마이크로리터의 항마우스 Cy2, 항토끼 Cy3 및 항염소 Cy5 항체와 3마이크로리터의 Hoechst 염료를 3밀