JoVE 실험 백과사전
면역학
0 조회수 • 4:59 분 • July 8th, 2025
적혈구(RBC)를 포함한 인간 전혈과 백혈구(단핵구 및 과립구와 같은 백혈구 또는 WBC) 및 기타 혈액 세포가 들어 있는 튜브로 시작합니다.
슈퍼옥사이드 지표인 디하이드로에티듐과 표지되지 않은 박테리아를 하나의 튜브에 도입합니다. 다른 튜브를 녹색 형광단 표지 박테리아로 처리합니다.
과립구와 단핵구는 박테리아의 병원체 관련 분자와 상호 작용하여 이를 식체 안에 삼켜줍니다.
이것은 식성 막 효소 NADPH 산화효소를 활성화하여 분자 산소를 슈퍼옥사이드 음이온으로 환원시킵니다.
슈퍼옥사이드 음이온은 산화 폭발을 일으키는 활성 산소종(ROS)인 과산화수소를 추가로 생성합니다.
포착체 내에서 ROS는 디하이드로에티듐을 산화시켜 박테리아 DNA를 염색하고 적색 형광을 부여하는 2-하이드록시 에티듐을 형성합니다.
세포외 형광을 소멸시키기 위해 소멸제를 도입합니다.
용해 용액을 추가하여 잠재적인 적혈구 간섭을 제거하고 백혈구를 고정합니다.
유세포 분석에서 녹색 형광을 가진 세포는 과립구와 단핵구의 식세포 활성을 확인하는 반면, 다른 튜브에서 빨간색 형광을 가진 세포는 이러한 세포에서 산소 버스트 활성을 나타냅니다.
절차를 시작하기 전에 혈액학 분석기를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 혈액 샘플에 대한 백혈구 감별 분석과 함께 전체 혈구 수를 수행합니다. 밀리리터당 세포 단위의 백혈구 수와 샘플의 호중구 및 단핵구 비율 값을 기록해 둡니다.
그런 다음 각 실험 및 대조 튜브에 대해 연장된 길이의 피펫 팁을 사용하여 리튬 헤파린 채혈 튜브에서 적절하게 라벨이 부착된 12 x 75mm 튜브의 바닥으로 각 전혈 샘플 100마이크로리터를 옮깁니다. 모든 혈액이 옮겨지면 HE 제어 튜브를 포함하여 빨간색 잉크와 H로 표시된 튜브에 10마이크로리터의 HE 작동 용액을 추가하고 튜브를 캡니다.
샘플을 잠시 소용돌이치고 튜브를 5분마다 부드럽게 흔들면서 개방형 금속 선반의 섭씨 37도 수조로 옮깁니다. 15분 후 랙과 튜브를 5분마다 부드럽게 흔들면서 12분 동안 얼음물 수조에 빠르게 옮깁니다.
배양이 끝나면 HE 대조군 튜브를 포함하여 빨간색 잉크와 H로 표지된 튜브에 적절한 부피의 표지되지 않은 황색포구균 작업 용액을 추가합니다. 캡으로 튜브를 잠시 소용돌이치십시오. 그런 다음 FITC 대조 튜브를 포함하여 검정색 잉크와 F로 표지된 튜브에 적절한 부피의 FITC 표지 황색 포르메우스 작업 용액을 추가하고 샘플을 잠시 소용돌이치게 합
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