기능화된 나노바디를 사용하여 GFP 표지된 표면 단백질이 골지횡단 네트워크에 도착하는 모니터링

GFP 태그 표면 단백질을 발현하는 황산염 결핍 암세포부터 시작합니다.

방사성 표지된 황산염과 변형된 항-GFP 나노바디(티로신-황산화 모티프를 운반하는 단일 사슬 항체)를 첨가하고 배양합니다.

황산염이 결핍된 세포는 방사성 표지 황산염을 내재화하여 세포 구성 요소에 통합합니다.

항-GFP 나노바디는 GFP 태그가 붙은 표면 단백질에 결합하여 소포로 엔도사이토시됩니다. 이 소포는 트랜스골지체 네트워크(TGN)를 포함한 특정 세포내 경로를 따라 나노바디-표면 단백질 복합체를 운반합니다.

TGN 내에서 기질이 있는 설포트랜스퍼라제는 방사성 황산염을 나노바디의 특정 티로신 잔기로 전달하여 방사성 표지화합니다.

세포를 씻으십시오. 다음으로 세포를 용해합니다.

용해물을 원심분리하여 큰 세포 파편을 제거합니다. 니켈 비드 기반 정제 방법을 사용하여 나노바디를 분리합니다.

분리된 분획을 SDS-PAGE 겔에 로드하여 방사성 표지된 나노바디를 별개의 밴드로 분리합니다.

젤을 자가방사선 촬영에 노출시킵니다.

결과 자방사선 사진은 방사성 표지된 나노바디의 존재를 나타내는 어두운 영역을 보여줍니다.

세포 배양 후드에서 GFP 태그 리포터 단백질을 안정적으로 발현하는 400,000 내지 500,000개의 HeLa 세포를 항생제가 함유된 완전 배지와 함께 35mm 접시 또는 6웰 클러스터에 시드합니다. 세포를 섭씨 37도에서 7.5% 이산화탄소와 함께 밤새 배양합니다. 다음날, 전체 배지를 제거하고 실온에서 1X PBS로 세포를 두 번 세척합니다. 황산염이 없는 배지로 세포를 섭씨 37도에서 7.5% 이산화탄소로 1시간 동안 굶주리게 합니다.

한편, 방사능 작업용으로 지정된 환기 후드 또는 벤치에서 황산염이 없는 배지에 황산염 S35 밀리리터당 0.5밀리큐리를 함유하는 황산염 표지 배지를 준비합니다. 다음으로, 1X PBS에 VHH 이중층-황프를 황산염 표지 배지와 혼합하여 밀리리터당 2마이크로그램의 최종 농도로 혼합합니다. 배양이 완료되면 황산염이 없는 배지를 황산나트륨 S35 및 VHH 이중층-황프를 포함하는 준비된 배지 혼합물 0.7밀리리터로 교체합니다. 방사능 작업을 위해 설계된 7.5% 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 세포를 1시간 동안 배양합니다.

그런 다음 라벨링 배지를 제거하고 냉각판 또는 얼음 위에서 얼음처럼 차가운 1X PBS로 세포를 2-3회 세척합니다. 용해 완충액 1밀리리터를 넣고 PMSF 2밀리몰과 프로테아제 억제제 칵테일 1배를 첨가합니다. 세포를 섭씨 4도의 흔들리는 플랫폼에서 10-15분 동안 배양합니다. 그런 다음 용해물을 긁어내어 새로운 1.5밀리리터 튜브로 옮기고 용해물을 소용돌이치고 섭씨 4도의 엔드 오버 엔드 로테이터에 10-15분 동안 놓습니다. 10,000g과 섭씨 4도에서 10분 동안 원심분리하여 핵 후 용해물을 준비합니다. 핵 후 용해물을 준비된 니켈 비드가 들어 있는 1.5밀리리터 튜브로 옮기고 섭씨 4도의 종단 간 셰이커에서 1시간 동안 배양하여 나노바디를 분리합니다.

그 후, 1X PBS 또는 용해 완충액으로 1000g에서 1분 동안 부드럽게 펠릿화하여 비드를 세 번 세척합니다. 비드에서 모든 세척 완충액을 조심스럽게 제거하고 50마이크로리터의 2X 샘플 완충액을 추가합니다. 섭씨 95도에서 5분간 끓인다. 그런 다음 끓인 비드를 미디 12.5% SDS-PAGE 겔에 로드하고 참조 염료가 분리 겔의 끝에 도달할 때까지 표준 PAGE 프로토콜에 따라 실행합니다. 분리 젤을 약 30밀리리터의 고정 완충액에 실온에서 1시간 동안 고정합니다. 약 50밀리리터의 탈이온수로 젤을 세 번 세척한 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 젤을 건조시킵니다. 건조가 완료되면 형광체 스크린 이미저를 사용하여 젤의 자가방사선 사진을 이미지화합니다.