기생충에 감염된 적혈구의 항체 매개 식세포작용(Antibody-Mediated Phagocytosis of Parasite-Infected Erythrocytes)을 정량화하기 위한 분석

열대열원충에 감염된 적혈구를 섭취하십시오. 기생충 시각화를 위해 기생충 DNA를 형광 염료로 라벨

링합니다.

이러한 기생충에 감염된 적혈구를 말라리아에 노출된 개인의 혈청과 함께 배양합니다. 이 세포는 표면에 기생충 항원을 표시하며, 이는 혈청에서 자연적으로 획득된 인간 IgG 항체에 부착되어 식균 작용을 위해 세포를 옵소닝합니다.

옵소화된 기생충에 감염된 적혈구를 인간 유래 단핵구 또는 식세포 세포의 현탁액을 포함하는 단백질 코팅 멀티웰 플레이트로 옮깁니다.

배양하는 동안 단핵구의 Fc-감마 수용체는 IgG 옵소화된 적혈구와 상호 작용하여 적혈구가 파고솜으로 삼켜지는 것을 유발합니다.

배양 후 플레이트를 원심분리하여 추가 세포 상호 작용을 방지하고 식균 작용을 중단합니다.

상청액을 버리십시오. 염화암모늄 용해 용액으로 처리하여 단핵구에 영향을 주지 않고 식균이 작용하지 않은 감염된 적혈구를 선택적으로 파열시킵니다.

용해 과정을 중지하기 위해 혈청 함유 완충액을 첨가하십시오. 용해된 적혈구를 포함하는 상청액을 원심분리하여 버립니다.

단핵구를 완충액에 재현탁합니다.

유세포 분석을 수행하여 기생충에 감염된 적혈구에서 형광을 나타내는 단핵구를 정량화하여 항체 매개 식균 작용을 확인합니다.

정제된 감염된 적혈구 현탁액을 에티듐 브로마이드를 함유한 기생충 배양 배지에서 밀리리터당 7번째 세포까지 3.3배 10씩 밀리리터당 2.5마이크로그램의 최종 농도로 조정한다. 다음으로, 플레이트를 폐기물 용기에 튕겨 하나의 96웰 플레이트에서 차단 용액을 제거합니다. 그런 다음 종이 타월 위에서 초과분을 제거하고 30마이크로리터의 에티듐 브로마이드 라벨 감염 적혈구 현탁액을 플레이트 상단 절반의 웰 1개를 제외한 모든 웰에 추가합니다. 빈 웰에 30마이크로리터의 기생충 배양 배지를 넣고 빛으로부터 보호된 실온에서 플레이트를 10분 동안 배양합니다.

배양이 끝나면 각 웰에 170마이크로리터의 기생충 배양 배지를 첨가하고 원심분리에 의해 플레이트 바닥에 감염된 적혈구를 침전시킵니다. 플레이트를 폐기물 용기에 튕겨 상청액을 제거하고 방금 시연한 것처럼 웰당 200마이크로리터의 기생충 배양 배지로 에티듐 브로마이드 표지된 감염된 적혈구를 두 번 더 세척합니다.

두 번째 세척 후, 다중 채널 피펫을 사용하여 펠릿을 방해하지 않고 각 웰에서 상청액의 전체 부피를 조심스럽게 제거하고 기생충 배양 배지에서 이전에 준비된 적절한 대조군 및 테스트 샘플을 포함하여 30마이크로리터의 항체 용액에 에티듐 브로마이드 표지된 감염된 적혈구를 재현탁합니다. 그런 다음 접시를 섭씨 37도에서 45분 동안 빛으로부터 보호합니다.

감염된 적혈구가 옵소닝되는 동안 원심분리에 의해 THP-1 세포를 수집하고 펠릿을 12밀리리터의 신선한 예열된 THP-1 세포 배양 배지에 재현탁합니다.

두 번째 원심분리 후, 계수를 위해 1밀리리터의 THP-1 세포 배양 배지에 펠릿을 재현탁하고, THP-1 세포 배양 배지에서 밀리리터당 5번째 세포에 대한 세포 농도를 5배 10으로 조절한다. 두 번째 96웰 플레이트에서 차단 용액을 제거하고 각 웰에 100마이크로리터의 THP-1 세포를 추가합니다. 그런 다음 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 넣습니다.

옵소화 배양이 끝나면 옵소나이션 플레이트의 각 웰에 170마이크로리터의 기생충 배양 배지를 첨가하고 원심분리에 의해 감염된 적혈구를 플레이트 바닥에 침전시킵니다. 다중 채널 피펫을 사용하여 웰당 200마이크로리터의 기생충 배양 배지로 옵소니화된 감염된 적혈구를 두 번 세척하여 두 번째 세척 후 상청액을 조심스럽게 제거합니다.

옵소나이션되고 감염된 적혈구를 웰당 100마이크로리터의 예열된 THP-1 세포 배양 배지에 재현탁하고, 각 옵소나이션되고 감염된 적혈구 현탁액 50마이크로리터를 식균작용 플레이트의 해당 웰로 옮깁니다. 모든 세포가 첨가되면 플레이트를 빛으로부터 보호한 세포 배양 인큐베이터에 40분 이상 두지 않습니다.

배양이 끝나면 섭씨 4도에서 원심분리하여 식균작용을 중단합니다. 상청액을 제거하고 웰당 150마이크로리터의 실온 염화암모늄 용해 용액으로 펠릿을 재현탁합니다. 정확히 3분 후, PBS에 얼음처럼 차가운 2% FBS 100마이크로리터를 첨가하여 용해를 멈추고 원심분리를 통해 온전한 세포를 침전시킵니다.

다음으로, 200마이크로리터의 신선한 얼음처럼 차가운 2% FBS를 PBS에서 웰당 세척할 때마다 세포를 세 번 세척합니다. 최종 세척 후, 웰당 PBS에 있는 200마이크로리터의 신선한 얼음처럼 차가운 2% FBS에 세포 펠릿을 재현탁합니다.

유세포 분석 획득 및 분석을 위해 세포를 즉시 유세포 분석기에 로드하고 감염된 적혈구가 없는 웰에 대해 선형 전방 대 선형 측면 산란 플롯을 사용하여 THP-1 세포를 게이트합니다. 이 게이트에서 10,000개의 이벤트를 획득하고 양성 대조군으로 옵소화된 감염된 적혈구가 있는 THP-1 세포를 사용하여 에티듐 브로마이드 형광 강도를 측정하기 위한 히스토그램 플롯을 설정합니다.

분석을 위해 감염된 적혈구가 없는 웰에 대한 선형 전방 대 선형 측면 산란 플롯을 열고 THP-1 세포를 게이트합니다. 그런 다음 FL3 히스토그램에 양성 게이트를 설정하고 이러한 게이트를 다른 모든 샘플 웰에 복사하여 에티듐 브로마이드 양성 THP-1 세포의 백분율을 결정합니다.