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면역학
0 조회수 • 2:59 분 • July 8th, 2025
호중구 세린 프로테아제 또는 NSP가 포함된 마이크로플레이트를 가져 와십시오. 호중구에 의해 분비되는 단백질 분해 활성을 가진 이러한 가용성 효소는 염증 반응에서 기능합니다.
NSP의 절단 부위 역할을 하는 인식 모티프를 운반하는 형광 리포터 프로브를 추가합니다. 프로브는 기증자와 수용체 형광단에 접합됩니다.
특정 파장에 의해 여기되면 기증자 형광단은 에너지를 방출합니다. 기증자와의 근접성으로 인해 수용체 형광단은 에너지를 흡수하고 다른 파장의 형광을 방출합니다.
기증자와 수용체 신호를 별도로 감지하고 기증자 대 수용자 비율을 계산하여 NSP 활동을 평가합니다. 낮은 비율은 프로브 절단이 없는 상태에서 기증자 형광의 소멸을 나타냅니다.
NSP는 프로브의 인식 모티프를 인식하고 절단하여 수용체를 방출합니다.
수용체로부터의 거리는 기증자 형광단에서 형광 방출을 가능하게 하여 기증자 대 수용체 비율을 증가시킵니다. 높은 비율은 NSP에 의한 효율적인 프로브 절단을 나타냅니다.
얼음 위에서 효소를 해동하고 텍스트 원고에 설명된 대로 효소 표준 곡선을 설정합니다. 표준 준비와 병행하여 가래 샘플을 활성화 완충액에 희석합니다. 플레이트 리더에서 NE FRET 프로브 NEmo-1의 여기 파장을 354나노미터로 설정하고 방출 파장을 기증체의 경우 400나노미터, 수용체의 경우 490나노미터로 설정합니다.
CG FRET 프로브 sSAM의 경우 여기 파장을 405나노미터로 설정하고 방출을 기증체의 경우 485나노미터, 수용체의 경우 580나노미터로 설정합니다. 40마이크로리터의 샘플, 표준물질 또는 블랭크를 Black 96웰 반영역 플레이트의 웰에 추가하고 마스터 믹스를 추가합니다.
플레이트 리더를 시작하고 최소 20분 동안 또는 신호의 증가가 정체기에 도달할 때까지 60-90초마다 기증자 대 수용자 비율 증가를 기록합니다. 데이터를 내보내고 각 시점 및 샘플에 대해 기증자 RFU를 수용체 RFU로 나누어 기증자 대 수용자 비율을 계산합니다. 그런 다음 기증자 대 수용자 비율 평균과 표준 편차를 계산합니다. 기증자 대 수용자 비율 변화의 선형 성장 내에서 기울기를 결정합니다.