암세포에 대한 사전 활성화된 CD8⁺ T 세포의 세포 독성을 연구하기 위한 체외 분석

두 개의 CD8⁺ T 세포 집단을 취하십시오: T 세포 및 공동 자극 수용체의 항체 매개 결합을 통해 사전 활성화된 이펙터 CD8⁺ T 세포와 골수 유래 억제 세포에 의해 억제된 CD8⁺ T 세포

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핵 제한 형광 단백질을 발현하는 암세포가 있는 기저막 코팅 웰에 이러한 T 세포를 추가합니다.

형광 발생 카스파제-3 기질(카스파제-3 인식 부위 함유 펩타이드에 접합된 DNA 결합 형광 염료)을 피펫팅합니다.

인큐베이트. 이펙터 T 세포 수용체는 암세포의 클래스 I MHC-펩타이드 복합체에 결합하여 퍼포린과 그란자임을 포함하는 세포독성 과립의 방출을 유발합니다.

퍼포린은 암세포막 기공을 생성하여 그랜자임 유입 및 카스파제 활성화를 허용하여 세포사멸을 시작합니다.

활성화된 카스파아제는 형광성 카스파제 기질을 추가로 절단하여 DNA에 결합하고 형광을 발하는 염료를 방출합니다.

형광 현미경 하에서 이펙터 T 세포와 공동 배양된 암세포는 암세포 세포사멸을 나타내는 이중 핵 형광을 나타냅니다.

대조적으로, 억제된 T 세포와 공동 배양된 암세포는 핵 단백질 형광만 나타내므로 세포사멸이 아닌 세포를 시사합니다.

사전 활성화된 CD8 양성 T 세포 표적 세포 공동 배양을 설정하기 위해, 먼저 현미경 검사에 적합한 96웰 평바닥 플레이트의 적절한 웰에 1 내지 100 희석된 성장 인자 감소 기저막 매트릭스 30마이크로리터를 추가합니다. 플레이트를 흔들어 매트릭스를 고르게 펴고 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 최소 1시간 동안 넣습니다. 플레이트가 평형을 이루는 동안 표적 세포를 준비합니다. 배지를 흡인하고 PBS로 세척한 다음 실온에서 1분 동안 0.05% 트립신-EDTA 1밀리리터를 첨가합니다.

소 태아 혈청이 보충된 DMEM 9밀리리터를 부드러운 피펫팅으로 첨가하고 해리된 세포를 튜브로 옮깁니다. 세포를 원심분리한 후 펠릿을 500마이크로리터의 EDMEM에 재현탁합니다. 세포 여과기를 통해 재현탁된 세포를 여과하고 살아있는 세포의 수를 계산합니다. 그런 다음 얼음 위의 신선한 EDMEM에서 밀리리터당 네 번째 표적 세포에 대한 밀도를 4배 10으로 조정합니다.

다음으로, 사전 활성화된 CD8 양성 T 세포를 몇 번 피펫팅하여 세포를 단일 세포 현탁액으로 재현탁하고 부유 T 세포를 조건당 하나의 1.5밀리리터 튜브로 옮깁니다. 웰당 200마이크로리터의 PBS로 남은 세포를 수집하고, 세척액을 적절한 1.5밀리리터 튜브로 옮기고