대식세포에서 다중 카스파제의 활성화에 대한 평가

부착된 골수 유래 대식세포가 포함된 멀티웰 플레이트로 시작합니다.

대식세포와 융합하여 바이러스 RNA를 함유한 리보핵단백질을 방출하는 인플루엔자 A 바이러스를 도입합니다.

대식세포의 Z-DNA 결합 단백질 1 또는 ZBP1은 바이러스 리보핵단백질과 상호 작용하여 키나아제 및 카스파제 8과 함께 ZBP1 올리고머화를 유발합니다.

올리고머화된 ZBP1은 인플라마좀 센서 단백질, 어댑터 단백질 및 프로카스파제-1을 추가로 모집하여 다량체 복합체인 PANoptosome을 형성합니다.

PANoptosome 내에서 개시제 카스파제-8은 근접 절단을 통해 활성화되어 카스파제-3 및 7을 포함한 이펙터 카스파제를 추가로 활성화합니다.

또한, PANoptosome 내의 인플라마좀 센서 단백질은 신호 전달 캐스케이드를 활성화하여 프로-카스파제-1을 활성 형태인 카스파제-1로 전환합니다.

동시에, 바이러스 감염은 미토콘드리아에서 시토크롬-c의 방출을 유도하여 아포토좀 활성화를 유발하고 프로-카스파제-9를 활성 형태로 전환합니다.

바이러스 감염은 또한 비표준 인플라마솜 경로를 유발하여 카스파제-11을 활성화합니다.

대식세포를 용해하기 위해 용해 완충액을 도입합니다. 용해물을 수집하고 가열하여 프로테아제를 비활성화하여 카스파제의 분해를 방지합니다.

추가 분석을 위해 여러 카스파제를 포함하는 상청액을 원심분리하고 수집합니다.

골수를 분리하고 BMDM을 분화한 후 세포를 인플루엔자 A 바이러스로 감염시킵니다. 20개의 플라크 형성 단위의 감염 다중도에서 필요한 바이러스 부피를 계산합니다. BMDM에서 배지를 제거하고 500마이크로리터의 PBS로 세포를 한 번 세척합니다. 열 비활성화 FBS가 없는 고포도당 DMEM에 450마이크로리터의 인플루엔자 A 바이러스를 각 웰에 추가하고, 플레이트를 섭씨 37도에서 가습된 인큐베이터에서 1시간 동안 배양하여 흡수할 수 있도록 합니다.

1시간 배양이 끝나면 50마이크로리터의 열 비활성화 FBS를 추가하고 플레이트를 섭씨 37도에서 총 12시간 동안 인큐베이터로 되돌립니다. 배양 12시간 후 인큐베이터에서 플레이트를 제거합니다. 150마이크로리터의 상청액을 흡인하고 상청액 분석을 위해 이를 폐기하거나 저장합니다. 남은 상층액을 제거하지 마십시오.

이제 웰당 50마이크로리터의 카스파제 용해 완충액과 100마이크로리터의 4X SDS 완충액을 결합하여 단백질 수집 용액을 만듭니다. 그런 다음 각 웰에 150마이크로리터의 혼합물을 추가합니다.

각 웰에 대해 혼합물을 피펫팅하여 용해된 세포와 상청액을 수집합니다. 피펫팅하는 동안 피펫 팁으로 웰 바닥을 긁어 세포를 파괴합니다. 긁고 피펫팅한 후 단백질 용해물을 라벨이 부착된 1.5밀리리터 튜브에 수집합니다. 히트 블록을 사용하여 모든 튜브를 섭씨 100도에서 12분 동안 가열합니다. 히트 블록에서 튜브를 제거하고 실온에서 30초 동안 14,500g에서 원 심분리하여 불용성 성분을 펠릿화합니다.