인간 눈물 샘플의 사이토카인을 분석하기 위한 멀티플렉스 비드 기반 분석

인간 눈물 샘플과 항체 비드 칵테일을 세척된 분석 플레이트에 추가합니다.

항체는 색상으로 구분된 자기 구슬에 결합되며, 고유한 스펙트럼 시그니처에 해당하는 다양한 비율의 형광단이 함침되어 다중 사이토카인 검출을 용이하게 합니다.

눈물 사이토카인은 해당 비드 결합 포획 항체에 결합합니다.

마그네틱 플레이트 와셔를 사용하여 항체-비드 복합체를 침전시킵니다. 완충액을 사용하여 결합되지 않은 생체 분자를 제거합니다.

결합된 사이토카인에 부착하는 비오티닐화된 검출 항체를 추가합니다.

피펫 스트렙타비딘-피코에리트린 접합체는 비오티닐화 항체에 결합합니다.

플레이트 와셔를 사용하여 결합되지 않은 웰 내용물을 제거합니다. 사이토카인 결합 복합체를 시스 액에 재현탁합니다.

샘플 분석 중에 유체 시스템은 비드 복합체를 광학 어셈블리로 운반합니다.

첫 번째 레이저는 내부 비드 염료를 활성화하고 결과 신호는 특정 사이토카인을 식별합니다.

두 번째 레이저는 신호 강도가 사이토카인 농도를 나타내는 비드 복합체에 결합된 리포터 분자를 활성화하여 여러 사이토카인을 동시에 정량화할 수 있습니다.

비드 기반 멀티플렉스 분석을 수행하려면 모든 시약을 실온으로 가져와 5-10초 동안 소용돌이치십시오. 용출된 눈물 샘플을 분석 전에 섭씨 영하 80도에서 보관한 경우 얼음 위에서 냉동 눈물 추출물을 해동하고 샘플을 1,000배 g에서 5분 동안 원심분리합니다. 인간 사이토카인 표준물질 QC-1, QC-2 및 샘플을 작업하기 위해 수직 구성으로 분석 워크시트를 준비합니다.

플레이트의 각 웰에 200마이크로리터의 1x 세척 완충액을 추가하고 플레이트 실러로 밀봉합니다. 그런 다음 플레이트를 실온의 플레이트 셰이커에서 10분 동안 배양합니다. 다음으로, 플레이트를 뒤집어 1x 세척 완충액을 디캔팅하고 흡수성 수건에 여러 번 두드려 웰에 남아 있는 세척 완충액을 제거합니다.

그런 다음 각 작동 인간 사이토카인 표준 QC-1, QC-2 및 분석 완충액 및 샘플만 포함된 블랭크 25마이크로리터를 적절한 웰에 추가합니다. 각 웰에 25마이크로리터의 분석 완충액을 추가합니다. 그런 다음 웰에 25마이크로리터의 1x 항체 비드 칵테일 용액을 추가합니다.

항체 비드 용액은 빛에 민감하므로 플레이트를 밀봉하고 알루미늄 호일과 플레이트 커버로 덮어 분석 중 빛으로부터 보호합니다. 셰이커에서 밤새 접시를 섭씨 4도에서 배양합니다. 다음날 자동 마그네틱 플레이트 와셔의 플레이트 랙에 플레이트를 놓고 1분 동안 그대로 두어 웰 바닥에 마그네틱 비드가 가라앉

웰 내용물을 흡인하고 자동 마그네틱 플레이트 와셔를 사용하여 웰당 200마이크로리터의 세척 완충액을 추가합니다. 접시를 1분 동안 그대로 두었다가 이전과 같이 우물 내용물을 흡입하고 세척을 한 번 더 반복합니다. 각 웰에 25마이크로리터의 검출 항체 용액을 첨가합니다. 플레이트를 밀봉하고 알루미늄 호일과 플레이트 커버로 덮은 다음 셰이커에서 실온에서 60분 동안 배양합니다. 그런 다음 각 웰에 25마이크로리터의 스트렙타비딘-피코에리트린 용액을 넣고 플레이트를 밀봉하고 덮은 후 셰이커에서 실온에서 30분 동안 배양합니다.

배양 후 플레이트를 마그네틱 플레이트 와셔에 놓고 1분 동안 그대로 둡니다. 그런 다음 웰 내용물을 흡인하고 웰당 200마이크로리터의 세척 완충액을 추가합니다. 1분 동안 그대로 두었다가 우물 내용물을 흡인한 후 다시 한 번 세척을 반복합니다. 각 웰에 150마이크로리터의 외피액을 추가합니다. 그런 다음 플레이트를 실온에서 5분 동안 셰이커에 올려 항체 비드를 재현탁한 후 플레이트를 읽고 사이토카인 농도를 분석합니다.