Immuno-RNA Fluorescence In Situ Hybridization을 사용하여 SARS-CoV-2 시각화

인터페론 결핍 포유류 세포주인 고정 및 투과화된 코로나바이러스에 감염된 Vero 세포를 예로 들어 보겠습니다.

숙주 내부에서 바이러스 RNA는 전사를 통해 합성된 특정 바이러스 단백질을 암호화하는 중간 길이 RNA 분자인 하위 게놈 또는 sgRNA로 존재합니다.

혼성화 연쇄 반응 또는 HCR 개시제 프로브를 추가합니다.

HCR 프로브는 표적 RNA의 상보적 서열에 결합합니다.

형광 표지된 올리고뉴클레오티드 헤어핀 프로브, H-1 및 H-2를 도입합니다.

개시제 프로브는 상보적인 H1 꼬리에 결합하여 헤어핀 구조를 선형화합니다.

노출된 H1 서열은 상보적인 H2 꼬리에 결합합니다.

후행 H2 서열은 H1 꼬리에 계속 결합하여 표적 영역 주변의 형광 태그 프로브를 증폭하고 강력한 신호를 생성합니다.

적절한 항체를 추가하여 숙주 세포 세포골격을 시각화합니다.

DAPI를 사용하여 핵을 염색합니다.

형광 현미경에서 바이러스에 감염된 세포는 세포질에 적색 형광을 나타내며 이는 표적 RNA의 존재를 나타냅니다.

텍스트 원고에 설명된 대로 세포를 고정하고 투과화한 후, 웰에서 1x PBS 용액을 제거하고 각 웰에 최소 300마이크로리터의 증폭 완충액을 추가합니다. 샘플을 실온에서 30분 동안 배양합니다. 별도의 튜브에서 원하는 부피를 스냅 냉각하여 각 HCR 헤어핀을 준비합니다.

300마이크로리터의 증폭 용액을 준비하려면 각 헤어핀에 18피카몰을 사용하십시오. 헤어핀 용액을 튜브에 옮기고 섭씨 95도에서 90초 동안 배양합니다. 그런 다음 어둠 속에서 30분 동안 실온으로 식힙니다. 스냅 냉각된 H1 및 H2 헤어핀을 증폭 완충액에 추가하여 헤어핀 혼합물을 준비합니다. 30-50마이크로리터의 헤어핀 혼합물을 파라필름에 떨어뜨리고 실온에서 어둠 속에서 밤새 샘플을 배양합니다.

슬라이드를 장착하려면 슬라이드에 10마이크로리터의 장착 매체 두 방울을 놓고 두 개의 커버슬립을 단일 슬라이드에 놓을 수 있도록 방울이 충분히 분리되어 있는지 확인합니다. 깨끗한 수건에 커버슬립을 두드려 여분의 액체를 제거합니다. 그런 다음 셀이 아래를 향하도록 퇴색 방지 마운팅 매체에 넣습니다. 장착된 샘플을 어둠 속의 건조하고 평평한 표면에 놓고 경화시키십시오.