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미세 중화 분석의 경우, 인플루엔자 특이적 중화 항체의 농도를 감소시키는 열 비활성화, 연속적으로 희석된 인간 혈청이 들어 있는 멀티웰 플레이트를 사용합니다.
병원성 인플루엔자 바이러스를 도입합니다. 혈청 항체는 바이러스와 상호 작용하여 중화합니다. 그러나 혈청 희석액이 높을수록 바이러스 중화가 제한됩니다.
Madine-Darby 개 신장 세포 또는 MDCK 세포로 종자하여 표면에 인간 시알산 잔기를 과발현합니다.
더 높은 희석에서 중화되지 않은 인플루엔자 바이러스는 세포의 시알산과 융합하여 바이러스 게놈을 세포 세포질로 방출합니다.
바이러스 유전자는 숙주 세포 내에서 바이러스 단백질과 핵단백질로 전사되어
번역됩니다.고정 및 투과성을 위해 고농도의 아세톤으로 치료하십시오.
바이러스 핵단백질과 상호 작용하는 1차 항체를 도입합니다.
1차 항체와 상호 작용하는 효소 접합 2차 항체와 오버레이합니다. 효소의 기질로 세척하고 처리하여 컬러 제품을 생성합니다.
색상 강도를 정량화하고 혈청 희석액에 대해 플로팅합니다. 50% 바이러스 중화를 달성하는 가장 높은 혈청 희석액은 중화 역가를 나타냅니다.
MN 분석의 1일차에 섭씨 37도 수조에서 혈청을 해동하고 해동 후 즉시 제거합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 섭씨 56도 수조에서 30분 동안 인간 혈청을 열비활성화합니다. 그런 다음 혈청을 얼음 위에 놓고 혈청에 바이러스 희석제를 첨가하여 1-10 사전 희석을 달성합니다.
하나의 바이러스로 테스트하려면 11열과 12열을 제외하고 B행에서 H행까지 50마이크로리터의 바이러스 희석제를 추가합니다. 그런 다음 희석된 혈청 10개 중 1개의 100마이크로리터를 열 A1 내지 A10에 추가합니다. 행 A에서 H까지 2배 연속 희석을 수행하고 행 H에서 마지막 50마이크로리터를 버립니다.
바이러스 제어를 위해 웰 A12, B12, C12 및 D12에 50마이크로리터의 바이러스 희석제를 추가합니다. 세포 대조군의 경우, 웰 E12, F12, G12 및 H12에 100마이크로리터의 바이러스 희석제를 첨가합니다. 대조군 혈청의 경우, 100마이크로리터의 희석된 대조군 혈청을 웰 A, 컬럼 11에 추가하고, 50마이크로리터의 바이러스 희석제를 웰 B11 내지 H11에 첨가한다. 연속적으로 희석하십시오. 플레이트를 덮고 바이러스를 추가할 준비가 될 때까지 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 배양합니다.
바이러스 첨가의 경우 바이러스 희석제를 사용하여 50마이크로리터에 바이러스를 100 TCID50으로 희석합니다. 백 적정 플레이트의 컬럼 11을 제외한 모든 웰과 모든 플레이트의 세포 대조군 웰 E12, F12, G12 및 H12를 제외한 모든 웰에 50마이크로리터의 희석된 바이러스를 추가합니다. 50마이크로리터의 바이러스 희석액을 열 11의 모든 웰에 추가합니다. 그런 다음 50마이크로리터에 100 TCID50의 바이러스 50마이크로리터를 첫 번째 웰에 첨가합니다.
다음으로, 50마이크로리터를 혼합하고 연속적인 웰에 옮겨 2배 연속 희석을 수행합니다. 바이러스 캐리오버를 방지하기 위해 웰 사이에서 피펫 팁을 교체하십시오. 웰 H11에서 50마이크로리터를 버린 다음 50마이크로리터의 바이러스 희석제를 컬럼 11에 첨가하여 최종 부피를 100마이크로리터로 만듭니다. 접시를 탭하여 섞습니다. 이전과 같이 1일째에 MDCK 세포 추가를 수행하고 2일째에 ELISA를 수행하기 전에 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 플레이트를 1시간 동안 배양합니다.
1차 및 2차 항체를 추가한 후, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 기질 추가 및 플레이트 판독을 수행합니다. 300마이크로리터의 세척 완충액으로 플레이트를 5번 세척하고 보푸라기가 없는 물티슈를 두드립니다. 각 웰에 새로 준비된 OPD 기질 100마이크로리터를 추가합니다. 그런 다음 바이러스 대조군 웰이 0.8에서 3 사이의 490나노미터에서 광학 밀도에 도달할 때까지 실온에서 플레이트를 배양하고, 세포 대조군은 0.2 미만의 낮은 배경 OD에서 배양합니다. 다음으로, 모든 웰에 100마이크로리터의 정지 용액을 추가합니다.
마이크로플레이트 분광 광도계를 사용하여 490나노미터에서 웰의 OD를 읽습니다. 마지막으로, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 각 혈청 샘플의 중화 항체 역가를 결정합니다.