면역 유도 시 애기장대 잎 디스크에서 산화 버스트를 감지하기 위한 분석

애기장대(Arabidopsis thaliana) 잎 디스크를 획득하세요. 건조를 방지하기 위해 이중 증류수가 들어 있는 마이크로플레이트 웰에 담그십시오.

부상에서 회복할 수 있도록 디스크를 배양합니다.

배양 후 물을 제거하십시오. 박테리아에서 추출한 펩타이드, 양 고추냉이 과산화효소 및 루미놀을 포함하는 반응 혼합물을 첨가합니다.

마이크로플레이트 리더를 사용하여 시간 경과에 따른 발광을 측정합니다.

식물 세포의 패턴 인식 수용체 또는 PRR은 미생물 관련 분자 패턴인 박테리아 펩타이드에 결합합니다.

또한, PRR은 보조 수용체와 결합하여 상호 인산화를 거치고 수용체 유사 단백질 키나아제를 활성화하고 세포내 칼슘 유입을 유발합니다.

이것은 차례로 막관통 호흡 폭발 산화효소 상동체 또는 RBOH 단백질을 활성화합니다.

활성화된 RBOH는 세포외 활성산소종(ROS)의 생성을 촉매하여 산화 폭발을 일으킵니다. 또한 ROS는 과산화수소로 전환됩니다.

양 고추냉이 과산화효소는 과산화수소를 사용하여 루미놀을 여기 상태로 산화시키고 바닥 상태로 돌아갈 때 발광을 방출합니다.

미

생물 패턴 인식 후 빠른 산화 폭발을 모니터링하기 위해 발광을 측정합니다.

발아 후 4-5주에 날카로운 4mm 생검 펀치를 사용하여 애기장대 식물당 하나의 잎 디스크를 제거하고 중간 정맥을 피하고 상처를 제한하도록 주의하십시오. 건조를 방지하기 위해 축면이 위로 향하도록 웰당 100마이크로리터의 이중 증류수가 들어 있는 사용하지 않은 96웰 발광계 플레이트의 개별 웰에 디스크를 수집합니다.

여러 유도자를 평가하는 경우, 각 유도자 처리에 대해 동일한 잎에서 두 번째 잎 디스크를 제거하고 뚜껑으로 플레이트를 덮어 잎 디스크가 실온에서 밤새 회복될 수 있도록 합니다. 다음날 아침, 마이크로플레이트 리더 매개변수를 40분에서 60분 간격으로 1,000밀리초 통합 시간으로 설정하여 동적 산화 버스트를 캡처합니다.

다음으로, 다중 채널 피펫을 사용하여 각 웰의 물을 각 유전자형에 대한 대조군 무유도자 반응을 포함하여 새로 준비된 반응 용액 100마이크로리터로 대체하여 유도가 없는 경우 기초 반응 산소종 수준을 평가합니다. 그런 다음 즉시 마이크로플레이트 리더에서 가시 스펙트럼의 모든 파장에 대한 발광을 측정합니다.