면역 유도 시 쌀 조직에서 반응성 산소종 생산을 검출하기 위한 분석

벼 묘목에서 잘라낸 균일한 칼집 부분과 벼 식물 잎에서 얻은 잎 디스크가 포함된 마이크로플레이트를 가져 가십시오.

멸균수를 넣고 밤새 배양하여 상처 스트레스를 회복할 수 있도록 합니다.

병원체 관련 분자 패턴 또는 PAMP로 작용하는 박테리아 편모에서 유래한 면역원성 펩타이드를 추가합니다.

절단 가장자리의 식물 세포는 패턴 인식 수용체를 통해 PAMP에 결합합니다.

결합은 다운스트림 신호 전달을 유발하여 호흡 버스트 산화효소 상동체 또는 RBOH라고 하는 원형질막 국소 효소를 활성화합니다.

활성화된 RBOH는 세포간 공간인 아포라스트에서 활성 산소종 또는 ROS를 생성합니다. 생성된 ROS는 과산화수소로 전환됩니다.

과산화효소 효소와 화학발광 기질을 첨가합니다.

과산화효소는 과산화수소를 사용하여 기질을 여기 상태 중간체로 변환하여 에너지를 빛으로 방출하고 기저 상태로 돌아갑니다.

두 조직 유형의 발광을 측정하여 PAMP 처리 직후 ROS 버스트를 나타내는 급격한 증가를 감지합니다.

ROS 분석 하루 전에 전처리를 위해 날카로운 면도날이나 수술용 칼날을 사용하여 10일 된 벼 묘목의 칼집을 3mm 조각으로 자릅니다. 100마이크로리터의 이중 증류수가 들어 있는 96웰 마이크로타이터 플레이트의 개별 웰에 10개의 시스 세그먼트를 10-12시간 동안 놓습니다.

플런저가 있는 생검 펀치를 사용하여 4주에서 6주 된 벼의 잎 디스크를 자릅니다. 데이터 변동을 줄이기 위해 항상 주 경운기의 두 번째 잎의 중간 3분의 1에서 잎 디스크를 자릅니다. 다음으로, 전처리를 위해 100마이크로리터의 이중 증류수가 들어 있는 96웰 마이크로타이터 플레이트의 개별 웰에 리프 디스크 하나를 10-12시간 동안 놓습니다. 잎 쪽 관련 변동을 피하기 위해 물 전처리를 위해 모든 잎 디스크를 미세타이터 플레이트의 우물에 뜨고 위를 향하게 유지하십시오.

9.4ml의 50마이크로몰 트리스-HCl, 400마이크로리터의 L-012 용액, 100마이크로리터의 양 고추냉이 과산화효소, 100마이크로리터의 flg22를 결합하여 유도 용액을 준비합니다. 200마이크로리터의 유도 용액을 웰에 추가합니다.

소프트웨어를 시작하고 실험 버튼을 클릭하여 새 프로토콜을 생성하거나 기존 프로토콜을 사용합니다. 팝업에서 Procedure(절차)를 클릭하여 플레이트를 설정하고 모니터링할 플레이트에서 웰을 선택합니다. 키네틱 시작을 클릭하고 실험 요구 사항에 따라 런타임을 30분 이상으로 설정합니다. 가능한 한 자주 판독값을 얻으려면 최소 간격을 선택하고 적분 시간은 신호 강도에 따라 1초 이상을 선택합니다.

Validate(유효성 검사)를 클릭한 다음 OK(확인)를 클릭하여 설정을 확인합니다. 그런 다음 팝업에서 새 플레이트 감지를 클릭하고 소프트웨어가 로드 플레이트 대화 상자를 표시할 때까지 기다립니다. 조직 손상이나 건조를 피하기 위해 전처리된 조직이 들어 있는 우물에서 이중 증류수를 조심스럽게 제거합니다. 다중 채널 피펫을 사용하여 조직이 포함된 웰에 200마이크로리터의 유도 용액을 추가합니다. 테스트할 플레이트를 캐리어에 놓고 감지를 시작합니다.