단핵구 단층에서 Fcγ 수용체 주도 식세포작용 연구를 위한 분석

적혈구 또는 RBC부터 시작하십시오.

RBC 표면 항원에 특이적인 다클론 항체를 추가합니다.

인큐베이트. 항체는 표면 항원에 대한 특이적 결합을 통해 적혈구를 코팅하여 적혈구를 옵소화합니다.

원심분리하여 결합되지 않은 항체를 제거합니다.

재현탁된 항체 옵소화된 적혈구를 단핵구 단층을 포함하는 다중 챔버 슬라이드에 추가합니다. 인큐베이트.

단핵구의 표면 Fc 감마 수용체는 적혈구에 결합된 다클론 항체의 Fc 영역에 결합합니다.

이 결합은 접촉 영역 주위에 Fc 수용체 클러스터링을 유발하고 세포 내 신호 전달을 유발하여 단핵구에서 액틴 세포골격 재구성을 초래합니다.

이 세포골격 재배열은 pseudopod 확장을 유도하고 옵소화된 적혈구 주위에 식세포 컵을 생성합니다.

식세포 컵은 점진적으로 옵소화된 적혈구를 둘러싸서 막에 결합된 식세포 내에서 완전히 삼

켜집니다.

배양 후, 슬라이드를 완충액으로 세척하여 식균되지 않은 적혈구를 제거합니다. 세포를 고정합니다.

장착 매체를 사용하여 슬라이드를 장착합니다.

위상차 현미경을 수행하여 단핵구 내에서 식균된 적혈구를 시각화하고 정량화합니다.

R₂R₂ 적혈구를 옵소나이즈화하려면 먼저 적혈구를 PBS에서 3회 세척합니다. 세 번째 원심분리 후 R₂R₂ 펠릿을 인간 혈청의 다클론 항-D 항체와 1:1 비율로 희석하여 간헐적으로 혼합하면서 섭씨 3도에서 1시간 동안 배양합니다. 옵소니제이션이 끝나면 인큐베이터에서 세포를 제거한 다음 방금 시연한 대로 PBS에서 세 번 더 세척합니다.

펠릿을 완전한 RPMI 배지에서 부피 대 부피 대비 1.25%로 재현탁합니다. 다음으로, 8챔버 슬라이드의 각 웰에서 상청액을 섭씨 37도에서 2시간 동안 400마이크로리터의 옵소니화된 R₂R₂ 세포로 교체합니다. 배양이 끝나면 슬라이드 어댑터를 사용하여 챔버를 제거하고 여분의 R₂R₂를 종이 타월로 두드립니다.

이제 100밀리리터 비커에 PBS를 채우고 각 슬라이드를 소금 용액에 30-40회 천천히 담가 식균이 없는 R₂R₂의 대부분을 제거합니다. 건조 후 슬라이드를 100% 메탄올에 45초 동안 고정하고 세포를 건조시킨 후 커버슬립으로 샘플을 장착합니다.

다음날, 각 슬라이드를 40x 대물 렌즈가 있는 위상차 현미경에 로드하고 각 손에 하나의 카운터를 사용하여 최소 200개의 단핵구와 각 단핵구 내에서 식균된 R₂R₂의 수를 수동으로 계산하여 샘플당 단핵구의 수와 식균된 R₂R₂ 세포의 수를 동시에