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면역학
0 조회수 • 5:13 분 • July 8th, 2025
마우스 수지상 세포 또는 동종 항원 또는 자가 항원의 유전적 변이를 운반하는 DC를 포함하는 멀티웰 플레이트로 시작합니다.
외래 항원을 인식하면서 자가 항원에 반응하지 않는 동종 반응성 T 세포를 포함한 마우스 T 세포를 도입합니다.
동종 반응성 T 세포는 이러한 동종 항원을 인식하고 DC와 상호 작용하여 F-액틴 재구성을 포함한 세포골격 재배열을 유발합니다.
이는 T 세포의 수용체가 DC의 공동 자극 분자와 결합하여 세포 연결(면역학적 시냅스)을 형성하도록 촉진합니다.
세포를 고정하고 튜브로 옮기고 T 세포 및 DC 수용체에 특이적인 형광색소 표지 항체 칵테일을 도입하여 뚜렷한 형광을 부여합니다.
결합되지 않은 항체를 제거하고 세포를 투과화하는 투과제와 F-액틴에 결합하는 녹색 형광단 태그 단백질 마커가 포함된 완충액에 세포를 재현탁합니다.
핵 염료가 포함된 완충액에 세포를 원심분리하고 재현탁하여 핵을 빨간색으로 염색합니다.
이미징 유세포 분석을 사용하여 시냅스 형성을 확인하는 T 세포 및 F-액틴의 녹색 십자선이 있는 DC 접합체에 해당하는 이중항을 식별합니다.
동종 반응성 정도를 나타내는 이중항을 정량화합니다.
96웰 세포 배양 플레이트의 각 웰에 0.5배 10 내지 여섯 번째 수지상 세포를 파종한 다음 10배 10 내지 여섯 번째 T 세포를 웰당 최대 50마이크로리터의 배양 배지의 최종 부피에 파종합니다. 저온 배양액을 섭씨 37도 및 이산화탄소 5%에서 4시간 동안 배양합니다.
그런 다음 PBS에 있는 1.5% 포름알데히드 배양 부피의 3배를 실온에서 30분 동안 각 웰에 첨가합니다. 고정이 끝나면 각 웰의 세포를 해당 5밀리리터 폴리스티렌 튜브로 옮기고, 빛으로부터 보호된 실온에서 30분 동안 100마이크로리터의 세척 완충액에 적절한 형광색소 접합 항체로 세포를 염색합니다.
다음으로, 세포를 1밀리리터의 세척 완충액으로 세척하고 펠릿을 팔로이딘-FITC가 포함된 파마 세척 완충액에 재현탁합니다. 빛으로부터 보호된 실온에서 30분 더 후, 신선한 파마 세척 완충액 1밀리리터로 세포를 세척합니다. 빛으로부터 보호된 실온에서 마지막 30분 배양을 위해 파마 세척 완충액에 관심 핵 염료에 펠릿을 재현탁하고, 파마 세척 완충액 1밀리리터로 세포를 세척한 후 세척 완충액 단독으로 1회 세척합니다. 그런 다음 세포를 50-100마이크로리터의 신선한 세척 완충액에 재현탁하고 세포를 작은 캡이 있는 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
세포 간 상호 작용을 분석하려면 먼저 명시야 이미지 획득을 위해 하나의 채널을 예약하고 첫 번째 제어 튜브를 로드합니다. 명시야 채널이 꺼진 상태에서 작업 공간 창에서 영역에 대한 종횡비와 함께 사용되는 각 채널에 대해 새 산점도를 만들고 종횡비가 1에 가까운 싱글렛을 게이트합니다.
각 형광색소에 대해 양성 모집단을 확인하고 필요에 따라 조명 상자의 레이저 전압을 조정합니다. 채널 상자에서 염색에 사용되는 형광색소에 적합한 채널을 선택합니다. 그런 다음 기록을 클릭합니다. 이벤트 수가 지정된 임계값에 도달하면 획득이 자동으로 중지됩니다.
모든 단일 염색 대조군을 획득한 후 첫 번째 실험 샘플 튜브를 로드하고 명시야 채널을 포함한 적절한 분석 채널에서 수만 개의 이벤트를 획득합니다.