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면역학
0 조회수 • 5:13 분 • July 8th, 2025
마우스 수지상 세포 또는 동종 항원 또는 자가 항원의 유전적 변이를 운반하는 DC를 포함하는 멀티웰 플레이트로 시작합니다.
외래 항원을 인식하면서 자가 항원에 반응하지 않는 동종 반응성 T 세포를 포함한 마우스 T 세포를 도입합니다.
동종 반응성 T 세포는 이러한 동종 항원을 인식하고 DC와 상호 작용하여 F-액틴 재구성을 포함한 세포골격 재배열을 유발합니다.
이는 T 세포의 수용체가 DC의 공동 자극 분자와 결합하여 세포 연결(면역학적 시냅스)을 형성하도록 촉진합니다.
세포를 고정하고 튜브로 옮기고 T 세포 및 DC 수용체에 특이적인 형광색소 표지 항체 칵테일을 도입하여 뚜렷한 형광을 부여합니다.
결합되지 않은 항체를 제거하고 세포를 투과화하는 투과제와 F-액틴에 결합하는 녹색 형광단 태그 단백질 마커가 포함된 완충액에 세포를 재현탁합니다.
핵 염료가 포함된 완충액에 세포를 원심분리하고 재현탁하여 핵을 빨간색으로 염색합니다.
이미징 유세포 분석을 사용하여 시냅스 형성을 확인하는 T 세포 및 F-액틴의 녹색 십자선이 있는 DC 접합체에 해당하는 이중항을 식별합니다.
동종 반응성 정도를 나타내는 이중항을 정량화합니다.
96웰 세포 배양 플레이트의 각 웰에 0.5배 10 내지 여섯 번째 수지상 세포를 파종한 다음 10배 10 내지 여섯 번째 T 세포를 웰당 최대 50마이크로리터의 배양 배지의 최종 부피에 파종합니다. 저온 배양액을 섭씨 37도 및 이산화탄소 5%에서 4시간 동안 배양합니다.
그런 다음 PBS에 있는 1.5% 포름알데히드 배양 부피의 3배를 실온에서 30분 동안 각 웰에 첨가합니다. 고정이 끝나면 각 웰의 세포를 해당 5밀리리터 폴리스티렌 튜브로 옮기고, 빛으로부터 보호된 실온에서 30분 동안 100마이크로리터의 세척 완충액에 적절한 형광색소 접합 항체로 세포를 염색합니다.
다음으로, 세포를 1밀리리터의 세척 완충액으로 세척하고 펠릿을 팔로이딘-FITC가 포함된 파마 세척 완충액에 재현탁합니다. 빛으로부터 보호된 실온에서 30분 더 후, 신선한 파마 세척 완충액 1밀리리터로 세포를 세척합니다. 빛으로부터 보호된 실온에서 마지막 30분 배양을 위해 파마 세척 완충액에 관심 핵 염료에 펠릿을 재현탁하고, 파마 세척 완충액 1밀리리터로 세포를 세척한 후 세척 완충액 단독으로 1회 세척합니다. 그런 다음 세포를 50-100마이크로리터의 신선한 세척 완충액에 재현탁하고 세포를 작은 캡이 있는 미세 원심분리기
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