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녹색 형광 생존율 염료로 염색된 면역 세포 집단을 포함하는 마우스 기관지폐포 세척액이 들어 있는 멀티웰 플레이트로 시작합니다.
면역 세포의 Fc 수용체를 차단하기 위해 Fc-항체를 도입합니다.
특정 세포 마커를 표적으로 하는 고유한 형광단 표지 항체의 칵테일을 추가합니다. 결합되지 않은 항체를 제거하고 세포를 완충액에 재현탁합니다.
유세포 분석을 사용하여 살아있는 세포를 나타내는 희미한 형광 일중항을 식별합니다.
488나노미터에서 세포를 비추어 세포가 CD11c 발현 세포와 상관관계가 있는 적색 형광을 방출하게 합니다.
높은 CD11c 집단 내에서 적절한 파장 필터를 사용하여 수지상 세포의 세포 마커 단백질 MHC-II와 대식세포의 SiglecF를 식별합니다.
CD11c 낮은 집단에서 T 세포에서 CD3의 발현과 B 세포에서 CD19의 발현을 통해 식별이 가능합니다.
405나노미터에서 세포를 비추고 청색 형광을 방출하여 CD11b 발현 호중구를 나타냅니다.
633나노미터에서 세포를 비추면 Ly-6G 발현 호산구에서 원적외선 형광단이 흥분됩니다.
유세포 분석 데이터를 사용하여 기관지폐포 세척액에서 각 유형의 면역 세포의 풍부함을 열거합니다.
세 번째 기관지폐포 세척 수집 후 풀링된 흡인액을 원심분리하고 상청액을 섭씨 영하 80도에서 보관합니다. 펠릿을 200마이크로리터의 ACK 용해 완충액에 재현탁합니다. 실온에서 2분 이내 후, 용해 완충액을 1밀리리터의 차가운 PBS로 희석하고 원심분리하여 세포를 수집합니다.
분석할 샘플 수에 대해 적절한 부피의 PBS에 펠릿을 재현탁하고 분석을 위해 세포를 96웰 플레이트의 적절한 웰 수에 분취합니다. 또 다른 원심분리를 통해 세포를 수집하고 PBS의 FC 블록 50마이크로리터에 펠릿을 재현탁합니다.
실온에서 10분 후, 각 웰에 50마이크로리터의 적절한 항체 칵테일을 첨가하고, 빛으로부터 보호된 섭씨 4도에서 세포를 30분 동안 배양한다. 배양이 끝나면 플레이트를 원심분리하고 상청액을 버리고 유세포 분석을 위해 펠릿을 웰당 200마이크로리터의 FACS 완충액의 최종 부피로 재현탁합니다.