0 조회수 • 6:08 분 • July 8th, 2025
마이코박테리아가 들어 있는 멀티웰 플레이트를 가져 가십시오. 웰에 증가하는 테스트 화합물 농도를 추가합니다.
인큐베이트. 마이코박테리아에 대한 화합물의 작용에 따라 마이코박테리아 성장을 억제하여 정균 활성을 나타내거나 마이코박테리아를 제거하여 살균 활성을 나타낼 수 있습니다.
테스트 화합물을 흡수하기 위해 활성탄이 포함된 한천이 포함된 마이크로플레이트인 숯 한천 레사주린 분석법 또는 CARA로 웰 분취량을 옮겨 이월 효과를 방지합니다.
인큐베이트. 화합물의 정균 활성은 마이코박테리아 복제를 억제하는 반면, 살균 활성은 마이코박테리아 생존력을 감소시킵니다.
완충액, 레사주린 및 비이온성 계면활성제를 첨가하여 레사주린을 우물에 분산시킵니다.
대사 활성 마이코박테리아에서 탈수소효소는 파란색의 약한 형광 레사주린을 분홍색 형광 레소루핀으로 환원시킵니다.
마이크로플레이트 리더를 사용하여 웰의 레소루핀 형광을 측정합니다.
레소루핀 형광이 없는 우물은 화합물의 살균 활성을 나타냅니다.
웰 전체에 걸쳐 다양한 형광 강도는 테스트 화합물의 농도 의존적 살균 또는 정균 효능을 반영하는 살아있는 박테리아 부하를 나타냅니다.
폴리프로필렌 원형 바닥 또는 원추형 원심분리기 튜브에 각각 4밀리리터 또는 20밀리리터의 Middlebrook 7H9-ADN 또는 7H9-OADC를 0.01 내지 0.1의 OD580에서 M. smegmatis와 접종합니다. M. smegmatis 배양액을 섭씨 37도 및 20% O2에서 흔들면서 배양하여 배양액을 중간 로그 단계 또는 대략적인 OD580 0.5로 확장합니다.
복제 및 비복제 조건에서 최소 억제 농도 스타일 실험을 설정하려면 0.01의 OD580에서 7H9-ADN에 있는 200마이크로리터의 세포를 바닥이 투명한 조직 배양 처리 96웰 플레이트의 모든 웰에 분배합니다.
비복제 분석의 경우, 0.02% tyloxapol을 함유한 PBS를 사용하여 세포를 두 번 세척하고 비복제 배지를 사용하여 세포를 재현탁합니다. 비복제 배지를 사용하여 세포를 OD580 0.1로 희석하고 새로 준비된 1몰 스톡에서 아질산나트륨을 0.5 내지 5밀리몰의 최종 농도로 첨가합니다.
0.1의 OD580에서 200마이크로리터의 세포를 바닥이 투명한 조직 배양 처리된 96웰 플레이트의 모든 웰에 분배합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 시험제를 준비한 후 시험제 #1 2마이크로리터를 A행에서 E행에, 시험제#2 마이크로리터를 E행에서 H행에 넣고 완전히 혼합합니다.
복제 분석을 위해 M. smegmatis 마이크로플레이트를 섭씨 37도, 20%O2 및 5% CO2에서 1 내지 48시간 동안 배양합니다. CARA가 판독값으로 사용되는 시점에서 50-75마이크로리터로 설정된 P200 다중 채널 피펫을 사용하여 위아래로 5-10회 피펫팅하여 MIC90 스타일 분석 플레이트의 웰 내용물을 조심스럽게 재현탁합니다. 그런 다음 피펫 팁을 사용하여 우물의 내용물을 원을 그리며 부드럽게 소용돌이칩니다.
희석되지 않은 분석 웰 내용물 10마이크로리터를 CARA 마이크로플레이트의 해당 웰로 옮기고, 이송 중 튀는 것을 방지하고, 10마이크로리터 분취량이 CARA 마이크로플레이트 웰의 중앙에 발견되도록 합니다. 플레이트 테이프를 사용하여 CARA 마이크로플레이트 스택을 묶은 다음 재밀봉 가능한 비닐 봉지에 넣습니다. M. smegmatis CARA 마이크로플레이트를 섭씨 37도에서 20%O2와 함께 복제 플레이트의 경우 1-2일, 비복제 플레이트의 경우 2-3일 동안 배양합니다.
박테리아 성장 필름 또는 더 큰 거시적 콜로니가 음성 대조군 웰에서 보이는 경우, 다중 채널 피펫과 함께 12개의 P200 팁 단일 세트를 사용하여 웰 측면을 따라 40마이크로리터의 멸균 PBS를 분배하고 PBS가 한천 박테리아 마이크로콜로니의 상단에 분포되도록 합니다.
5mg의 레사주린과 50ml의 5% Tween-80을 PBS에 혼합하여 CARA 현상 시약을 준비합니다. 새로 준비된 CARA 현상 시약 50마이크로리터를 CARA 마이크로플레이트의 각 웰에 추가합니다. 그런 다음 플레이트를 앞뒤로 몇 번 흔들어 각 웰의 한천과 박테리아 매트에 시약을 분배하는 데 도움을 줍니다. 플레이트를 재밀봉 가능한 비닐 봉지에 넣고 M. smegmatis에 대해 섭씨 37도에서 최소 30분 동안 배양합니다.
형광을 판독하기 전에 CARA 마이크로플레이트를 뚜껑을 제거한 상태에서 실온에서 15분 동안 생물안전 후드에 넣습니다. 생물안전 캐비닛 외부에서 BSL3 분광 광도계를 사용하는 경우 플레이트 위에 광학 품질 PCR 스티커를 붙이고 부드러운 종이 타월을 사용하여 스티커 표면을 부드럽게 눌러 단단히 밀봉하십시오. 530나노미터에서 여기하고 590나노미터에서 방출하는 상단 판독을 통해 형광을 결정합니다.