JoVE 실험 백과사전
면역학
0 조회수 • 6:08 분 • July 8th, 2025
마이코박테리아가 들어 있는 멀티웰 플레이트를 가져 가십시오. 웰에 증가하는 테스트 화합물 농도를 추가합니다.
인큐베이트. 마이코박테리아에 대한 화합물의 작용에 따라 마이코박테리아 성장을 억제하여 정균 활성을 나타내거나 마이코박테리아를 제거하여 살균 활성을 나타낼 수 있습니다.
테스트 화합물을 흡수하기 위해 활성탄이 포함된 한천이 포함된 마이크로플레이트인 숯 한천 레사주린 분석법 또는 CARA로 웰 분취량을 옮겨 이월 효과를 방지합니다.
인큐베이트. 화합물의 정균 활성은 마이코박테리아 복제를 억제하는 반면, 살균 활성은 마이코박테리아 생존력을 감소시킵니다.
완충액, 레사주린 및 비이온성 계면활성제를 첨가하여 레사주린을 우물에 분산시킵니다.
대사 활성 마이코박테리아에서 탈수소효소는 파란색의 약한 형광 레사주린을 분홍색 형광 레소루핀으로 환원시킵니다.
마이크로플레이트 리더를 사용하여 웰의 레소루핀 형광을 측정합니다.
레소루핀 형광이 없는 우물은 화합물의 살균 활성을 나타냅니다.
웰 전체에 걸쳐 다양한 형광 강도는 테스트 화합물의 농도 의존적 살균 또는 정균 효능을 반영하는 살아있는 박테리아 부하를 나타냅니다.
폴리프로필렌 원형 바닥 또는 원추형 원심분리기 튜브에 각각 4밀리리터 또는 20밀리리터의 Middlebrook 7H9-ADN 또는 7H9-OADC를 0.01 내지 0.1의 OD580에서 M. smegmatis와 접종합니다. M. smegmatis 배양액을 섭씨 37도 및 20% O2에서 흔들면서 배양하여 배양액을 중간 로그 단계 또는 대략적인 OD580 0.5로 확장합니다.
복제 및 비복제 조건에서 최소 억제 농도 스타일 실험을 설정하려면 0.01의 OD580에서 7H9-ADN에 있는 200마이크로리터의 세포를 바닥이 투명한 조직 배양 처리 96웰 플레이트의 모든 웰에 분배합니다.
비복제 분석의 경우, 0.02% tyloxapol을 함유한 PBS를 사용하여 세포를 두 번 세척하고 비복제 배지를 사용하여 세포를 재현탁합니다. 비복제 배지를 사용하여 세포를 OD580 0.1로 희석하고 새로 준비된 1몰 스톡에서 아질산나트륨을 0.5 내지 5밀리몰의 최종 농도로 첨가합니다.
0.1의 OD580에서 200마이크로리터의 세포를 바닥이 투명한 조직 배양 처리된 96웰 플레이트의 모든 웰에 분배합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 시험제를 준비한 후 시험제 #1 2마이크로리터를 A행에서 E행에, 시험제#2 마이크로리터를 E행에서
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