대식세포의 TLR-dependent NF-кB/AP-1 transcription factor signaling에 대한 분석

유도 가능한 프로모터 하에서 분비된 배아 알칼리성 포스파타제 또는 SEAP 효소에 대한 유전자가 있는 리포터 대식세포가 포함된 튜브를 섭취하십시오.

하나의 튜브에 대식세포 Toll 유사 수용체 2 또는 TLR2에 특이적인 항체를 도입하여 활성을 중화합니다.

다른 방법에서는 TLR4 신호 전달을 억제하기 위해 억제제를 추가합니다. 마지막 튜브는 처리하지 않고 그대로 두십시오.

손상 관련 분자 패턴 또는 DAMP(세포 괴사 중에 방출되는 단백질)의 흡착층이 있는 챔버 슬라이드를 가져 가십시오.

처리된 대식세포와 처리되지 않은 대식세포를 별도의 웰에 넣고 배양합니다.

처리되지 않은 대식세포의 TLR2 및 TLR4는 DAMP에 결합하여 전사 인자 핵 인자-카파-B 또는 NF-κB 및 활성화제 단백질-1 또는 AP-1을 활성화합니다.

이들은 핵으로 전위하고 SEAP 프로모터에 결합하여 세포외에서 분비되는 SEAP 생산을 상향 조절합니다.

SEAP 함유 상청액을 발색 기질이 있는 마이크로플레이트로 옮깁니다.

SEAP는 기질을 가수분해하여 보라색-파란색 제품을 생성합니다. 흡광도를 측정합니다.

TLR2 중화는 SEAP 생성을 강력하게 감소시켜 TLR2가 1차 매개체임을 나타냅니다.

톨 유사 수용체 매개 NF-kB/AP-1 활성에 대한 흡착된 단백질층의 효과를 평가하기 위해, 적절한 크기의 플라스크에서 리포터 대식세포를 70% 합류로 성장시킨 후, 시연된 대로 적절한 효소 해리 용액으로 세포를 분리합니다.

분석 배지에 밀리리터당 7.3 x 10⁵ 세포 농도로 세포를 재현탁하고 3개의 튜브 사이에 세포를 고르게 분취합니다. 실온에서 60분 동안 TLR4 억제제 밀리리터당 1마이크로그램으로 세포의 첫 번째 튜브를 처리합니다. 두 번째 튜브는 밀리리터당 50마이크로그램의 항-TLR2 항체로 실온에서 30분 동안 처리하고 세 번째 튜브는 처리하지 않고 실온에 그대로 둡니다.

세포가 배양되는 동안 200마이크로리터의 용해물과 10% 소 태아 혈청을 조건당 3개의 끈적끈적한 웰에 추가합니다. 각 웰에 대해 새로운 파스퇴르 피펫으로 단백질 용액을 흡인하기 전에 적절한 실험 기간 동안 단백질이 섭씨 37도에서 흡착되도록 하고 웰당 250마이크로리터의 PBS로 끈적끈적한 웰 표면을 세척당 5분 동안 세 번 세척합니다.

리포터 대식세포 처리가 끝나면 각 웰에 200마이크로리터의 세포 용액을 추가합니다. 회로도에 표시된 대로 밀리리터당 150나