0 조회수 • 5:54 분 • July 8th, 2025
혈청이 결핍된 배지에 마우스 섬유아세포가 포함된 멀티웰 플레이트를 섭취하십시오. TNFα 특이적 항체의 연속 희석액을 추가합니다.
염증성 사이토카인인 TNFα를 추가합니다.
인큐베이트. 혈청 박탈은 세포 스트레스를 유발하여 세포를 TNFα 매개 세포사멸에 취약하게 만듭니다.
혈청 결핍 세포의 수용체에 결합하는 TNFα는 세포내 신호 전달 캐스케이드를 유발하여 카스파제 캐스케이드를 활성화하고 세포사멸을 유도합니다.
그러나 TNFα에 대한 항체 결합은 수용체 결합을 방지하여 카스파제 활성화를 억제합니다.
배양 후, ATP 및 마그네슘 이온과 함께 세제, 발광 카스파제 기질, 루시페라아제 효소를 함유한 시약 혼합물을 첨가합니다. 혼합하고 배양합니다.
세제는 막을 투과시켜 TNFα 유도 세포에서 카스파제를 방출합니다.
생물발광 기질은 카스파제 인식 부위를 포함합니다. 특정 카스파제는 기질을 절단하여 아미놀루시페린을 생성합니다.
루시페라제는 기질인 아미놀루시페린을 산화시켜 빛을 방출합니다.
발광 강도를 측정하여 항체 농도가 증가함에 따라 발광 감소를 감지하여 TNFα를 중화하고 TNFα 유도 세포사멸을 예방하는 TNFα 특이적 항체의 효능을 나타냅니다.
컬럼 2에서 시작하여 11번째 컬럼까지 분석 플레이트의 내부 60웰에 50마이크로리터의 세포 현탁액을 추가합니다. 마이크로플레이트에 분취량을 추가하기 위해 피펫팅하여 세포 현탁액을 혼합합니다. 즉시 매핑된 희석액 50마이크로리터를 분석 플레이트로 옮깁니다.
평행 레인의 경우 마이크로피펫을 돌려 희석액을 분배합니다. 매핑된 희석액은 다음 순서로 웰에 분배할 수 있습니다. 컨트롤은 주변 우물에 분배됩니다.
TNF-알파를 500마이크로리터의 초순수로 희석합니다. 2,200RPM에서 와류 혼합기로 혼합합니다. 15mL 튜브로 옮기고 마지막으로 분석 배양 배지로 mL당 40나노그램으로 희석합니다. 50마이크로리터의 세포사멸 유도 용액을 60개의 내부 외부 우물에 분배합니다. 마이크로리터의 세포사멸 유도 용액을 60개의 내부 분석 웰에 분배합니다. 마지막으로 16시간 동안 배양합니다.
다섯째 날에 제조업체의 지침에 따라 완충 용액으로 기질을 재구성합니다. 5번 뒤집어 섞습니다. 기질 용액을 분배하고 분석 플레이트의 각 샘플 웰에 50마이크로리터의 기질 용액을 추가합니다. 또한 컨트롤에 기판을 추가합니다. 와류 혼합기에서 400RPM으로 분석을 3분 동안 교반합니다.
믹서에서 분석 플레이트를 꺼내 실온에서 배양합니다. 플레이트 리더 분광 광도계를 켭니다. Softmax Pro 소프트웨어 또는 이에 상응하는 프로그램을 엽니다. 마이크로플레이트를 분광 광도계에 로드하고 다음 매개변수를 조정합니다.
릭 유형의 발광 기능을 엔드포인트 함수로 활성화합니다. 열 1과 12를 제외한 리그 영역을 조정합니다. 플레이트 유형을 96웰 표준 투명 바닥 마이크로플레이트로 선택합니다. 통합 시간을 최대 1250밀리초까지 변경합니다. 마이크로플레이트의 흔들림 시간을 10초로 조정합니다. 기준 물질, 분석 물질 및 대조 샘플이 배치될 벽을 선택합니다. 읽기 시작한다.