림프구 증식을 유도하기 위한 백신 펄스 수지상 세포 기반 체외 분석

지상 세포 배양에 테스트 백신 항원을 추가하는 것으로 시작합니다.

수지상 세포는 항원을 인식하고, 수용체 매개 엔도사이토시스를 통해 내재화하고, 이를 더 작은 펩타이드로 단편화하고, 생성된 항원-MHC 복합체를 제시를 위해 세포 표면으로 전달합니다.

원 제시 수지상 세포를 순진한 T 림프구와 공동 배양하여 T 세포 수용체와 항원-MHC 복합체 및 보조 수용체 사이의 상호 작용을 가능하게 합니다.

이것은 면역학적 시냅스 형성으로 이어져 세포 내 신호 전달을 통해 T 림프구를 활성화합니다.

활성화된 T 림프구는 클론 확장을 거쳐 이펙터 T 림프구를 생성합니다.

인터루킨-2 또는 IL-2, 사이토카인 분자를 배양액에 첨가하고 배양합니다. IL-2의 결합은 세포내 신호 전달을 유발하여 림프구의 증식과 생존을 가능하게 합니다.

소량의 배양액과 원심분리기를 가져 가십시오. 상청액을 버리십시오. 항원 제시 수지상 세포로 세포 펠릿을 재현탁하고 동일한 웰로 옮깁니다.

항원에 의한 재자극은 림프구 증식을 증가시킵니다.

림프구 증식과 관련된 특정 마커를 정량화하기 위해 다운스트림 분석을 수행합니다.

항원 펄스 MoDC를 생성하려면 광견병 바이러스 백신 또는 RV 현탁액 밀리리터당 1마이크로리터를 24웰 플레이트의 나이브 MoDC 배양액 1밀리리터에 첨가하고 플레이트를 5% 이산화탄소 및 섭씨 37도에서 48시간 동안 배양합니다. 7일째에 항원 펄스 MoDC가 포함된 24웰 플레이트를 얼음 위에 10분 동안 보관한 후 웰당 1밀리리터의 얼음처럼 차가운 PBS를 첨가하고 완전히 혼합합니다. 현탁액을 15밀리리터 튜브로 옮깁니다.

음처럼 차가운 PBS 2밀리리터로 우물을 씻습니다. 각 웰 내에서 잔류 세포를 수집하고 세척된 내용물을 해당 튜브로 옮깁니다. 세포 현탁액을 500g에서 7분 동안 원심분리합니다. 상청액을 폐기한 후, 항원 펄스 MoDCs 세포 펠릿을 완전한 배양 배지에 재현탁하여 밀리리터당 100,000개 세포의 최종 농도를 조정합니다.

MoDC 림프구 공동 배양의 경우, 항원 펄스의 7일째에 순진한 림프구 세포 현탁액 1밀리리터와 항원 펄스 또는 비항원 펄스 MoDC 현탁액 1밀리리터로 멸균 24웰 플레이트의 웰을 파종합니다. 배양 2일 후, 각 웰에 밀리리터당 20나노그램의 재조합 인터루킨-2를 보충하고 추가로 120시간 동안 배양을 계속합니다.

14일째에 공동 배양액 1밀리리터를 멸균 1.5밀리리터 튜브로 옮기고 튜브를 원심분리합니다. 그런 다음 1밀리리터의 항원 펄스 또는 비펄스 MoDC로 세포 펠릿을 재현탁합니다. 잘 섞고 세포 현탁액을 해당 웰로 옮깁니다.

PBMC 및 나이브 림프구 및 단핵구의 세포 표면 염색 후, 피펫을 사용하여 세포 현탁액 1밀리리터를 멸균 1.5밀리리터 튜브에 옮기고 500g에서 10분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 펠릿을 PBS 1밀리리터에 재현탁하고 15밀리리터 튜브로 옮깁니다. 또한 PBS 1밀리리터를 사용하여 잔여 세포와 해당 튜브를 수집합니다. 그런 다음 세포가 들어 있는 15밀리리터 튜브에 10밀리리터의 PBS를 첨가하고 피펫팅으로 혼합합니다.

튜브를 850g에서 7분 동안 원심분리한 후 상청액 을 제거하고 상청액을 디캔팅한 후 남은 잔류 현탁액으로 세포 펠릿을 조심스럽게 재현탁합니다. 세포 현탁액을 V-바닥 96웰 플레이트로 옮기고 유출을 방지하기 위해 웰을 밀봉합니다.

염색이 완료되면 유세포 분석기 분석을 수행합니다. 실시간 미리보기에서 전압, 이득 및 세포 크기를 포함한 형광 임계값을 조정하여 결국 세포 파편을 제외하면서 원하는 세포 집단 주위에 게이트를 그립니다.