단일 세포에서 단백질 분비물을 감지하기 위한 국소 표면 플라즈몬 공명 이미징

카르복실기를 포함하는 자체 조립 단층이 있는 기능화된 금 나노 구조 어레이를 특징으로 하는 유리 센서 칩으로 시작합니다.

미세유체 어셈블리 내에 칩을 고정하고 링커를 도입하여 카르복실기를 활성화합니다.

펩타이드 리간드를 추가하여 링커를 통해 활성화된 카르복실기와 접합합니다.

비활성화제 화합물 함유 완충액으로 처리하고 비특이적 결합 부위를 비활성화하고 완충액으로 세척합니다.

편광을 칩에 집중시킵니다. 국부적인 표면 플라즈몬 공명 이미징 시스템을 사용하여 어두운 배경에 밝은 사각형으로 나타나는 어레이의 이미지를 얻습니다.

공명각에서 금 전자는 빛을 흡수합니다. 해당 각도에서 반사된 빛의 강도를 측정하여 센서 응답을 생성합니다.

칩에 결합하고 세척하는 단백질 분비 하이브리도마 세포를 도입합니다.

부착된 세포는 근처 어레이의 리간드와 상호 작용하는 단백질을 분비합니다.

이러한 상호 작용은 반사된 빛의 각도와 강도를 변경하여 센서 반응의 변화를 일으켜 세포의 분비 활동을 확인합니다.

국부적인 표면 플라즈몬 공명 또는 LSPR 칩을 세척하고 재생하기 위해 5% 수소와 95% 아르곤의 300밀리리터 혼합물에서 45초 동안 40와트의 전력으로 플라즈마 재를 방출합니다. SPO와 SPC의 3:1 비율로 구성된 2성분 에탄올 티올 용액에 칩을 담그어 플라즈마 회분 직후 금 표면과 나노 구조를 기능화합니다. 칩을 티올 용액에 밤새 방치하여 자체 조립된 단층을 형성한 후 에탄올로 헹구고 질소 가스로 건조시킵니다.

바닥 조각에 칩을 놓아 맞춤형 미세유체 홀더 내에 LSPR 칩을 로드합니다. 그런 다음 이 하단 조각과 실리콘 개스킷 사이에 칩을 끼우고 4개의 나사를 사용하여 투명한 플라스틱 상단 조각을 끼워 어셈블리를 고정합니다.

일반적인 SPC 기반 티올 적용의 경우 탈이온화 증류수에 133밀리몰 EDC와 33밀리몰 NHS의 1:1 혼합물 300마이크로리터를 드롭 코팅하여 SPC 티올 성분의 카르복실기를 활성화합니다. 10분 동안 기다린 후 10밀리몰 PBS로 표면을 수동으로 헹굽니다.

그런 다음 300마이크로리터의 리간드 용액을 드롭 코팅하여 활성화된 카르복실기를 관심 리간드와 접합시킵니다. 1시간 동안 기다린 후 10밀리몰 PBS로 표면을 헹구고 칩의 PBS에 300마이크로리터의 0.1몰 에탄올아민을 드롭 코팅하여 비특이적 결합을 최소화합니다. 10분 동안 기다린 후 0.005% 트윈 20 또는 PBS-T20을 함유한 PBS로 에탄올아민을 세척합니다.

다음으로, 변화하는 메니스커스와 관련된 데이터의 변동을 줄이기 위해 칩 위에 석영 조각을 배치합니다. 현미경에 장착하는 동안 PBS-T20 버퍼로 칩을 젖은 상태로 유지하십시오. 정상 상태에 도달할 때까지 미세유체 튜브를 어셈블리 및 흐름 버퍼에 부착합니다. 그런 다음 LSPR 팁 어셈블리를 가열된 스테이지에 단단히 놓습니다.tage 샘플 홀더.

이 방법에 대한 광학 설정은 다음과 같습니다. 할로겐 램프의 빛은 593 나노미터 길이의 패스 필터를 통과하여 나노 플라즈몬 반응에 기여하지 않는 파장을 제거합니다. 그런 다음 빛은 선형으로 편광되고 플라즈몬 금 나노 구조의 여기를 위해 40x 1.4 수치 조리개 대물렌즈를 통해 샘플이 조명됩니다. 산란 된 빛은 대물렌즈에 의해 수집되고 교차 편광판을 통과하여 유리 기판의 배경 신호를 줄입니다. 50/50 빔 스플리터는 동시 분광 및 이미지 분석을 위해 수집 된 광 경로에 삽입됩니다.

어셈블리와 현미경이 최소 2시간 동안 평형을 이루도록 한 후 조이스틱을 사용하여 칩을 정렬하여 중앙 어레이가 분광학을 위해 광섬유와 정렬되도록 합니다. 하이브리도마 세포를 원심분리하여 배양하고 펠릿화한 후 수확합니다. 그런 다음 LSPR 칩에 도입하기 전에 생존 가능성을 테스트합니다. 그런 다음 마이크로피펫을 사용하여 50마이크로리터의 세포 용액을 LSPR 칩에 수동으로 도입합니다. 마지막으로, 미세유체 관류 시스템을 사용하여 신선한 무혈청 배지로 용액에 남아 있는 세포를 씻어내어 이미징을 위한 LSPR 칩을 준비합니다.