포유류 세포에서 벌크 자가포식 격리 활성(Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells) 정량화

대량 자가포식은 분해를 위해 자가포식 화물과 젖산 탈수소효소 또는 LDH를 포함한 가용성 세포질 단백질을 자가포식체 내에 격리하는 것을 포함합니다.

대량 자가포식 활성을 반영하는 LDH 격리를 평가하려면 자가포식-리소좀 분해를 차단하기 위해 억제제로 처리된 영양이 부족한 세포가 있는 전기천공 큐벳을 복용하십시오.

전기천공을 수행하여 세포막을 선택적으로 파괴하고 가용성 단백질을 방출합니다.

세포 성분을 보존하기 위해 세포 파괴물을 완충된 자당 용액과 혼합합니다.

필요한 희석된 파괴물 용액을 완충액 함유 튜브로 옮깁니다. 분리하여 격리되지 않은 LDH를 자가포식체로 격리된 LDH에서 분리합니다.

총 세포 LDH 분획을 포함하는 나머지 희석된 파괴물 용액을 다른 튜브로 옮깁니다.

비이온성 계면활성제 함유 완충액을 두 튜브에 첨가하여 격리된 LDH 분획과 총 LDH 분획을 추출합니다.

LDH 함유 상청액을 원심분리하여 피루브산염 및 NADH가 있는 완충액 함유 튜브로 옮깁니다.

LDH는 NADH 산화를 통해 피루브산을 젖산으로 전환하여 LDH 농도와 상관관계가 있는 NADH 수치를 감소시킵니다.

LDH 격리를 결정하기 위해 침전된 세포 및 총 세포 분획에서 LDH를 정량화합니다.

피펫을 사용하여 세포 펠릿을 재현탁하여 거의 단일 세포 현탁액을 얻습니다. 이 현탁액을 4mm 전기천공 큐벳으로 옮깁니다. 큐벳을 지수 붕괴파 전기천공기에 넣고 800볼트, 25마이크로패럿 및 400옴에서 단일 전기 펄스를 방전합니다.

새 피펫 팁을 사용하여 세포를 파괴하는 세포를 400마이크로리터의 얼음처럼 차가운 인산염 완충 자당 용액이 들어 있는 1.5mm 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기고 피펫팅으로 잠시 혼합합니다. 각 샘플에 대해 이 재현탁, 전극 파괴 및 혼합 과정을 반복합니다. 절차를 처음 수행하는 경우 텍스트에 설명된 대로 효율적이고 선택적인 원형질막 전극 파괴를 확인하십시오.

침전된 LDH 분획을 얻으려면 희석된 각 세포 파괴 용액에서 550마이크로리터를 제거하고 0.5% BSA 및 0.01% Tween-20이 포함된 900마이크로리터의 얼음처럼 차가운 재현탁액이 들어 있는 자체 2밀리리터 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 피펫을 약간 섞습니다. 18,000배 g 및 섭씨 4도에서 45분 동안 원심분리하여 침전된 LDH를 함유한 펠릿을 생성합니다. 흡입을 사용하여 상청액을 완전히 흡인하여 펠릿을 가능한 한 건조하게 둡니다.

침전된 LDH 샘플은 분석할 준비가 될 때까지 섭씨 영하 80도에서 보관합니다. 총 LDH 분획의 경우, 희석된 각 세포 파괴 용액에서 150마이크로리터를 자체 새 튜브로 옮깁니다. 분석할 준비가 될 때까지 섭씨 영하 80도의 냉동고에 보관하십시오.

전된 LDH와 총 LDH 샘플을 얼음 위에서 모두 해동합니다. 해동되면 1.5% Triton X-405를 함유한 얼음처럼 차가운 재현탁액 완충액 300마이크로리터를 전체 LDH 샘플에 첨가합니다. 냉장실에서 롤러에서 샘플을 30분 동안 회전시킵니다. 다음으로, 침전된 LDH 샘플에 1% Triton X-405를 함유한 얼음처럼 차가운 재현탁액 완충액 750마이크로리터를 첨가합니다. 용액이 균질해질 때까지 피펫을 사용하여 펠릿을 재현탁합니다. 모든 샘플을 섭씨 4도에서 18,000배 g에서 5분 동안 원심분리하여 용해되지 않은 세포 파편을 침전시킵니다.

원심분리가 완료되면 샘플을 얼음 위에 놓습니다. 텍스트에 설명된 고전적인 효소 분석 또는 상업적으로 이용 가능한 다양한 키트를 사용하여 상청액의 LDH 수준을 결정합니다.