Mycobacterium tuberculosis 감염 모델에 대한 약물 효능을 평가하기 위한 분석

확립된 결핵균 또는 Mtb 감염 모델이 포함된 멀티웰 플레이트를 가져 와십시오.

우물에는 감염되지 않은 대식세포로 둘러싸인 조밀하게 채워진 Mtb 및 Mtb에 감염된 괴사성 대식세포의 코어로 구성된 세포 응집체가 포함되어 있어 생체 내 감염을 모방합니다.

항생제 리팜피신과 목시플록사신을 연속적으로 희석하십시오.

감염 플레이트에서 배지를 버리고 항생제 희석액을 웰로 옮기고 배양합니다.

항생제는 세포 응집체를 통해 확산되어 박테리아 세포로 들어갑니다.

리팜피신은 박테리아 RNA 중합효소에 결합하여 RNA 합성을 억제하고 박테리아 사멸을 유발합니다.

Moxifloxacin은 박테리아 DNA 토포이소머라제에 결합하여 복제를 억제하고 박테리아 성장을 억제합니다. 결합은 또한 활성 산소종의 축적을 포함하여 스트레스 반응을 유도하여 박테리아를 죽입니다.

배양 후 산화환원 지표인 레사주린을 첨가합니다. 살아 있고 대사적으로 활발한 박테리아 내부에서 산화환원효소 효소는 파란색 레사주린을 분홍색 형광 레소루핀으로 환원시킵니다.

형광을 측정하여 생존 가능한 박테리아를 검출합니다.

박테리아 생존율은 항생제 농도가 증가함에 따라 감소하여 Mtb에 대한 효능을 나타냅니다.

약물 검사를 위해 다음과 같이 새로운 96웰 플레이트에 두 가지 항결핵제를 세 번씩 준비합니다. 먼저, 125마이크로리터의 7H9-C 배지를 웰 B2에서 G10까지 첨가합니다. 다음으로, 7H9-C 1밀리리터에서 원하는 최고 최종 농도의 두 배로 두 약물을 준비합니다.

피펫을 사용하여 각 약물 250마이크로리터를 웰 B, C 및 D-11에 추가한 다음 E, F 및 G-11을 각각 3회 처리합니다. 다음으로, 다중 채널 피펫을 사용하여 B11에서 G11을 통해 B10에서 G10으로 125마이크로리터를 이동하여 테스트 약물을 연속적으로 두 배 희석합니다. 각 단계에서 5회 피펫팅하여 혼합합니다.

125마이크로리터를 컬럼에서 컬럼으로, 플레이트를 가로질러 오른쪽에서 왼쪽으로 계속 이동하고 컬럼 4 이후에 중지합니다. 열 4를 혼합한 후 125마이크로리터를 폐기물 용기에 버립니다. 2열과 3열에는 약물이 포함되어서는 안 됩니다. 이를 통해 배경 및 긍정적인 성장 제어에 사용할 수 있습니다.

다음으로, 인큐베이터에서 Mtb에 감염된 대식세포가 포함된 96웰 플레이트를 회수합니다. 플레이트를 기울이지 않고 다중 채널 피펫을 사용하여 웰 B2에서 G11까지 150마이크로리터의 배