바이러스 감염의 항체 의존성 증진을 조사하기 위한 In vitro assay

지카 바이러스에 대한 항체가 포함된 혈청 샘플을 연속적으로 희석한 마이크로플레이트를 채취합니다.

뎅기열 리포터 바이러스 입자 또는 RVP를 추가하고 배양합니다.

조작된 RVP는 구조 단백질이 있는 외피와 형광 단백질을 암호화하는 게놈 RNA를 포함하는 뉴클레오캡시드로 구성됩니다.

뎅기열과 지카 바이러스의 외피 단백질의 구조적 상동성으로 인해 항체가 RVP와 교차 반응하여 복합체를 형성합니다.

RVP에 의한 감염에 허용되지 않는 인간 백혈병 세포를 추가합니다.

세포는 RVP 결합 항체를 인식하는 Fc 수용체를 가지고 있어 RVP가 엔도좀 내부로 들어가는 것을 촉진합니다(항체 의존성 강화 또는 ADE라고 함).

세포를 펠릿화하고 내재화되지 않은 RVP를 포함하는 상청액을 버립니다. 성장 배지를 추가하고 배양합니다.

RVP와 엔도솜막의 pH 의존적 융합은 뉴클레오캡시드를 방출하고, 뉴클레오캡시드는 분해되어 게놈 RNA를 방출하여 형광 단백질 발현을 가능하게 합니다.

세포를 고정하고 유세포 분석을 사용하여 분석합니다.

적절한 항체 농도에서 더 높은 형광은 RVP 내재화가 증가했음을 나타내며 감염이 강화되었음을 나타냅니다.

실온에서 혈청 샘플을 해동하는 것부터 시작합니다. 해동되면 각 혈청 샘플 100마이크로리터를 멸균 튜브로 옮기고 섭씨 56도에서 30분 동안 열 비활성화합니다.

다음으로, 저온 RPMI-10에서 1:1에서 1,000 범위의 혈청 샘플을 10배 연속 희석합니다. 그런 다음 희석된 각 혈청 샘플 10마이크로리터를 멸균 96웰 V-바닥 플레이트의 웰로 옮깁니다.

다음으로, 덴기열 1, 2, 3 및 4 리포터 바이러스 입자를 섭씨 37도 수조에서 해동하여 혈청 샘플당 각 RVP의 부피를 약 170마이크로리터로 보장합니다. 해동되면 즉시 RVP 튜브를 얼음으로 옮깁니다. 그런 다음 10마이크로리터의 RVP를 혈청 샘플 희석액이 들어 있는 웰에 무혈청 대조군 웰에 피펫팅합니다. 위아래로 5-10회 피펫팅하여 완전히 혼합합니다.

96웰 V-바닥 플레이트를 인큐베이터로 옮기고 5% 이산화탄소가 있는 상태에서 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다. 96웰 V-바닥 플레이트가 배양되는 동안 생물 안전 캐비닛의 표면을 70% 에탄올로 청소하고 UV 광선을 15분 동안 실행합니다.

그런 다음 인큐베이터에서 K562 세포의 완전히 합류한 T75 플라스크를 제거합니다. 멸균 5밀리리터 피펫을 사용하여 세포를 잘 혼합하고 5