JoVE 실험 백과사전
면역학
0 조회수 • 3:53 분 • July 8th, 2025
유도 프로모터 하에서 분비된 배아 알칼리성 포스파타제 또는 SEAP, 유전자 또는 분비된 루시페라아제 유전자를 포함하는 다른 리포터 대식세포가 있는 멀티웰 플레이트를 가져 와서 보십시오.
지질다당류 또는 LPS와 혼합된 다양한 펩타이드-금 나노입자 하이브리드를 포함하는 배지를 지정된 웰에 추가합니다.
LPS는 대식세포 톨 유사 수용체 또는 TLR에 결합하여 엔도좀으로의 내재화를 유발합니다.
엔도솜 양성자 펌프는 양성자를 내부로 운반합니다. 산성화는 TLR 신호 전달을 유발하여 전사 인자를 활성화합니다.
이러한 인자는 리포터 유전자의 발현을 유도하여 SEAP 또는 루시페라아제를 생성합니다.
대안적으로, 하이브리드와 함께 LPS의 내재화는 음전하를 띤 펩타이드 그룹이 내강 양성자를 격리하여 엔도솜 산성화를 방지하고 TLR 신호 전달을 억제합니다.
배지를 수집하고 원심분리하여 상청액을 분리하고 SEAP 및 루시페라아제용 기질을 추가합니다.
SEAP는 기질을 유색 제품으로 변환하는 반면, 루시페라아제는 기질을 촉매하여 발광을 생성합니다.
리포터 신호의 감소는 TLR 신호 억제에서 하이브리드의 효과를 나타냅니다.
1.5밀리리터 에펜도르프 튜브에 20부피의 펩타이드-GNP 하이브리드 용액을 18,000배 g으로 30분 동안 원심분리합니다. 상청액을 조심스럽게 버리십시오. 잡종을 하나의 신선한 튜브로 옮기고 PBS 1밀리리터로 두 번 세척합니다. 그 후, 세척된 잡종을 R10 배지 한 부피에 재현탁합니다. 혼합된 농축된 잡종과 LPS 함유 R10 배지를 동일한 부피로 혼합하여 잡종과 LPS의 최종 농도가 각각 밀리리터당 1000나노몰 및 10나노그램이 되도록 합니다.
다음으로, 대식세포 배양 플레이트에서 배양 배지를 제거합니다. 100마이크로리터의 하이브리드-LPS 혼합물을 각 웰에 각 조건에 대해 3회 반복하여 추가합니다. 음성 대조군과 LPS 대조군을 포함합니다. 섭씨 37도에서 24시간 동안 배양한 다음 각 웰의 배지를 별도의 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 튜브를 섭씨 4도에서 18,000배 g으로 30분 동안 원심분리합니다. 상청액을 신선한 96웰 원형 바닥판으로 옮깁니다.
이러한 샘플에 대한 리포터 분석을 시작하려면 새로운 96웰 평평한 바닥 플레이트의 각 웰에 180마이크로리터의 예열된 QUANTI-Blue 용액을 추가한 다음 각 샘플에서 20마이크로리터의 상청액을 이 플레이트로 옮깁니다. 짙은 파란색이 1 이상의 광학 밀도로 발전할 때까지 섭씨 37도에서 1-2시간 동안 배양합니다. 그런 다음 플레이트 리더를 사용하여 655나노미터에서 흡수를 기록합니다. 다음으로, 각 샘플에서 10마이크로리터의 신선한 상청액을 96웰 투명하고 바닥이 평평한 흰색 플레이트로 옮깁니다.
자동 주입기를 사용하여 각 웰에 50마이크로리터의 루시페라아제 용액을 추가하고 즉시 발광을 웰별로 기록합니다. 그런 다음 잠재적 후보의 억제 효과를 검증하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 TLR 특이성을 평가합니다.