기계감각수용체에 대한 항체로 처리된 혈소판에 대한 전단 응력의 영향

혈소판이 풍부한 혈장이 포함된 멀티웰 플레이트로 시작합니다. 혈소판은 기계적 자극에 반응하는 표면 기계 수용체 복합체를 발현합니다.

기계수용체 복합체는 세포외 리간드 결합 도메인과 기계감각 도메인에 연결된 매크로-글리코펩티드 영역을 포함합니다.

항-기계수용체 항체를 도입하여 반대쪽 혈소판에 있는 수용체의 리간드 결합 도메인과 가교합니다.

항체 처리된 혈장 현탁액의 방울을 점도계의 어셈블리 사이에 놓습니다.

전단 응력을 가하고, 기계적 힘을 시뮬레이션하고, 항체 결합 수용체를 혈소판에서 멀리 당겨 기계적 감각 영역에서 거대 당펩타이드 영역을 해리시킵니다.

이것은 기계 감각 영역의 형태 변화를 유발하여 혈소판을 활성화하고 표면 마커의 발현을 초래합니다.

전단된 혈소판 현탁액을 멀티웰 플레이트 내의 새 웰로 옮깁니다.

해당 혈소판 표면 마커와 상호 작용하는 형광단 표지 마커 특이적 분자의 칵테일을 도입하고 고정 용액으로 세포를 고정합니다.

유세포 분석에서 뚜렷한 형광 신호는 항체 처리된 혈소판에 대한 전단 응력의 영향과 상관관계가 있습니다.

리간드 처리의 경우, 혈소판이 풍부한 혈장에 관심 항체 또는 리간드를 천천히 첨가하고 혈소판을 부드럽게 혼합합니다. 배양하는 동안 콘 플레이트 점도계를 켜고 플레이트 온도를 섭씨 22도로 설정합니다. 5-10분 후, 처리된 혈소판 풍부 혈장을 플레이트 중앙에 있는 온도 제어 콘 플레이트 점도계로 직접 옮기고, 모든 샘플이 접촉 지점의 콘과 플레이트 사이에 침착되도록 주의합니다.

샘플에 전단을 적용하려면 점도계 설명서에 따라 전단을 계산하고 적절한 속도와 지속 시간으로 샘플에 전단을 적용하십시오. 도포가 끝나면 원뿔을 플레이트에서 약 2mm 들어 올려 샘플이 플레이트와 콘 모두에 접촉하도록 하고 젤 로딩 피펫 팁을 사용하여 샘플 부피의 중심에서 5-10마이크로리터를 수집합니다. 그런 다음 전단된 샘플을 관심 표면 마커에 대한 항체와 함께 실온에서 20분 동안 배양하고 샘플을 실온에서 20분 동안 2% 파라포름알데히드에 고정합니다.

유세포 분석법으로 샘플을 분석하려면 각 조건에 대해 최소 20,000개의 이벤트를 수집하고 각 형광단의 강도에 대한 높이 값을 사용하여 각 형광 마커의 신호 강도를 정량화합니다. 그런 다음 소 혈청 알부민 또는 비히클이 포함된 음성 대조군을 사용하여 음성 배경 형광 이벤트를 제외한 게이트를 그리고 모든 실험 조건에 대해 게이트 내부의 이벤트 백분율을 정량