대식세포에서 기생충의 세포 내 성장을 정량화하기 위한 In vitro 분석

골수 유래 대식세포 또는 BMM이 있는 커버슬립이 포함된 두 개의 마이크로플레이트를 섭취합니다.

Leishmania metacyclic promastigotes(길쭉한 편모 단계)를 한 판에 추가하고 amastigotes(타원형의 편모가 없는 단계)를 다른 판에 추가합니다.

배양하는 동안 기생충은 대식세포 수용체에 결합하여 수용체 매개 식균 작용을 유발합니다.

식체는 소포체 및 골지체 장치에서 파생된 리소좀 및 소포와 융합하여 기생 액포로 성숙합니다.

액포의 pH 감소는 전유세포를 무박기로 분화하고 그 복제를 유발합니다.

내재화되지 않은 기생충을 제거하기 위해 세척하십시오.

감염된 대식세포를 고정하고 세제를 첨가하여 세포와 기생충을 투과시킵니다.

형광 핵산 염료를 도입하여 대식세포와 기생충 핵을 염색합니다.

커버슬립을 슬라이드에 장착하고 형광 현미경으로 관찰하여 더 큰 숙주 핵과 주변의 더 작은 무스티고트 핵을 정량화합니다.

무스티고트 수를 비교하여 초기에 미분화 전유기체에 감염된 대식세포와 복제 무스티고트에 감염된 대식세포 내에서 증식을 평가합니다.

L. Amazonensis로 세포를 감염시키려면, 기생충 현탁액을 적절한 실험적 감염 다중도로 희석하고, 실험의 모든 시점을 포함하여 모든 6-웰 플레이트의 각 웰에 50 내지 100 마이크로리터의 기생충을 첨가한다. 적절한 감염 기간과 온도를 위해 골수 유래 대식세포를 배양합니다. 그런 다음 웰당 칼슘이나 마그네슘이 없는 신선한 섭씨 37도 PBS 2밀리리터로 웰을 3회 세척하고 초기 시점 샘플을 1.5-2밀리리터의 2% 파라포름알데히드로 10분 동안 고정합니다.

나중 시점에 해당하는 플레이트의 경우, 신선한 골수 유래 대식세포 배지 2밀리리터를 각 웰에 추가하고 플레이트를 적절한 인큐베이터로 되돌립니다. 그런 다음 방금 설명한 대로 남은 각 시점에 대해 세포를 고정 및 세척하고 샘플을 섭씨 4도에서 신선한 PBS에 보관합니다.

DAPI로 세포를 염색하려면 상청액을 칼슘과 마그네슘이 없는 신선한 PBS 1.5밀리리터로 교체하고 실온에서 10분 동안 0.1% 비이온성 세제를 보충한 다음 칼슘이나 마그네슘이 없는 PBS로 2밀리리터를 세 번 세척합니다. 다음으로, 실온에서 1시간 동안 PBS 1밀리리터에 DAPI 밀리리터당 2마이크로그램으로 세포를 염색합니다.

세 번 세척한 후, 커버슬립을 셀 쪽이 아래로 향하도록 시중에서 판매되는 퇴색 방지 마운팅 시약이 장착된 개별 유리 현미경 슬라이드에 놓습니다. 그런 다음 감염된 세포의 수를 정량화하기 위해 형광 현미경과 Emanuel 카운터의 100x 침지 오일 대물렌즈를 사용하여 DAPI로 염색된 각 큰 대식세포 핵 주위에 클러스터된 더 작은 무박기 핵의 수를 식별합니다.