항균 단백질의 효소 활성을 정량화하기 위한 염료 방출 분석

열사멸된 박테리아 현탁액이 들어 있는 튜브로 시작하여 염료 용액으로 처리합니다.

염료 분자는 박테리아 세포벽의 필수 구성 요소인 펩티도글리칸에 공유 결합하여 파란색을 부여합니다.

박테리아를 펠릿화하고 결합되지 않은 염료 분자를 포함하는 상청액을 제거합니다.

박테리아를 재현탁시키고 항균 단백질 용액을 튜브에 도입하여 박테리아 펩티도글리칸의 효소 가수분해를 유발하여 세포벽 분해 후 세포 용해를 일

이것은 염료 분자의 방출로 이어져 파란색을 부여합니다.

단백질 변성제인 에탄올을 첨가하여 항균 단백질을 비활성화하고 효소 반응을 종료합니다.

내용물을 원심분리하여 세포 조각과 효소를 펠릿화합니다. 염료 분자 함유 상청액을 멀티웰 플레이트로 옮깁니다.

플레이트 리더를 사용하여 595나노미터에서 흡광도를 측정합니다.

효소 처리 샘플의 흡광도와 효소 처리되지 않은 샘플의 흡광도를 비교하여 항균 단백질의 효소 활성을 정량화합니다.

염료 방출 분석에서 기질은 Remazol Brilliant Blue R 염료 또는 RBB에 공유 결합됩니다. 200밀리몰 RBB 용액을 만들어 이 프로토콜을 시작합니다. 새로 준비된 수산화나트륨 용액에 RBB 1.25g을 녹입니다.

다음으로, 열사멸된 박테리아 세포를 습윤 중량 0.5g의 농도로 RBB 용액 30밀리리터에 재현탁합니다. 정제된 펩티도글리칸의 경우, 펩티도글리칸을 습윤량 0.3g의 농도와 RBB 용액 30밀리리터의 농도로 재현탁합니다.

후속 단계는 사용된 기질에 관계없이 동일하기 때문에 라벨링은 박테리아 세포에 대해서만 시연됩니다. 반응 혼합물을 회전 플랫폼에서 섭씨 37도에서 6시간 동안 부드럽게 혼합하여 배양합니다. 6시간 후, 반응 혼합물을 섭씨 4도 인큐베이터로 옮기고 부드럽게 혼합하면서 추가로 12시간 동안 배양합니다.

배양이 완료되면 3,000배 g에서 30분 동안 원심분리하여 염색된 기질을 수확합니다. 기판 펠릿에서 염료 용액을 디캔팅합니다. 펠릿을 유형 1의 물에 완전히 재현탁한 후 원심분리합니다. 이러한 방식으로 염료 표지 세포를 3-5회 세척하여 기질에서 비공유 결합 가용성 염료를 제거합니다.

최종 세척의 경우 염료 방출 분석에 사용될 펠릿 부분을 1.5밀리리터 미세분리기 튜브로 옮깁니다. 마지막 세척의 상청액은 투명해야 하며 기질은 파란색으로 유지되어야 합니다. 염색된 기질을 최소한의 물에 현탁시켜 사용할 준비가 될 때까지 섭씨 영하 20도에서 보관합니다.

염료 방출 분석을 준비하기 위해 냉동 염색된 기질을 실온으로 되돌리고 효소에 대해 경험적으로 결정된 분석 완충액으로 두 번 세척합니다. 이 경우 PBS가 사용됩니다. 200마이크로리터 반응 부피에 수행할 염료 방출 분석 수를 곱하여 필요한 기질 현탁액의 부피를 계산합니다.

기질 현탁액을 준비하려면 먼저 염색된 기질을 적절한 부피의 PBS에 첨가합니다. 일대일 희석을 하고 PBS를 블랭크로 사용하여 595나노미터에서 광학 밀도를 초기 측정합니다. 595나노미터에서 2.0의 광학 밀도가 달성될 때까지 현탁액에 염색된 기판을 증분 첨가합니다.

이 시연에서 염료 방출 분석은 단백질 항균제에 대한 최적의 배양 조건을 결정하는 데 사용됩니다. 먼저, 프로토콜 텍스트에 설명된 대로 PBS를 사용하여 농도를 밀리리터당 1밀리그램으로 조정하여 스톡 단백질 항균 현탁액을 준비합니다. 그런 다음 스톡 단백질 항균 현탁액을 마이크로리터당 100나노그램의 농도로 희석합니다.

이 농도는 분석 반응에 첨가된 부피당 1마이크로그램의 단백질의 최종 반응 질량을 제공합니다. 평가할 열 범위에 대해 0.5밀리리터 미세분리기 튜브에서 반응 분석을 수행합니다. 각 열 조건에 대해 10마이크로리터의 스톡 단백질을 200마이크로리터의 준비된 기질 현탁액에 첨가합니다.

열 순환기에서 8시간 동안 배양하고 시간당 한 번 반전으로 혼합합니다. 배양 후, 각 미세분리기 튜브에 25마이크로리터의 에탄올을 첨가하여 반응을 중단시킵니다. 소화되지 않은 불용성 기질을 제거하려면 3,000배 g에서 2분 동안 원심분리합니다. 그 후, 소화되지 않은 기질의 펠릿을 방해하지 않도록 주의하면서 각 반응 혼합물에 대해 150마이크로리터의 반응 상청액을 96웰 평평한 바닥 마이크로플레이트로 옮깁니다.

효소 활성을 정량화하려면 마이크로플레이트 분광 광도계를 사용하여 595나노미터에서 상청액의 흡광도를 측정합니다. 표지된 기질에서 상청액으로 방출되는 가용성 염료에 의한 흡광도 증가는 효소 활성의 정량적 측정입니다.