항균 단백질의 효소 활성을 정량화하기 위한 염료 방출 분석

열사멸된 박테리아 현탁액이 들어 있는 튜브로 시작하여 염료 용액으로 처리합니다.

염료 분자는 박테리아 세포벽의 필수 구성 요소인 펩티도글리칸에 공유 결합하여 파란색을 부여합니다.

박테리아를 펠릿화하고 결합되지 않은 염료 분자를 포함하는 상청액을 제거합니다.

박테리아를 재현탁시키고 항균 단백질 용액을 튜브에 도입하여 박테리아 펩티도글리칸의 효소 가수분해를 유발하여 세포벽 분해 후 세포 용해를 일

으킵니다.

이것은 염료 분자의 방출로 이어져 파란색을 부여합니다.

단백질 변성제인 에탄올을 첨가하여 항균 단백질을 비활성화하고 효소 반응을 종료합니다.

내용물을 원심분리하여 세포 조각과 효소를 펠릿화합니다. 염료 분자 함유 상청액을 멀티웰 플레이트로 옮깁니다.

플레이트 리더를 사용하여 595나노미터에서 흡광도를 측정합니다.

효소 처리 샘플의 흡광도와 효소 처리되지 않은 샘플의 흡광도를 비교하여 항균 단백질의 효소 활성을 정량화합니다.

염료 방출 분석에서 기질은 Remazol Brilliant Blue R 염료 또는 RBB에 공유 결합됩니다. 200밀리몰 RBB 용액을 만들어 이 프로토콜을 시작합니다. 새로 준비된 수산화나트륨 용액에 RBB 1.25g을 녹입니다.

다음으로, 열사멸된 박테리아 세포를 습윤 중량 0.5g의 농도로 RBB 용액 30밀리리터에 재현탁합니다. 정제된 펩티도글리칸의 경우, 펩티도글리칸을 습윤량 0.3g의 농도와 RBB 용액 30밀리리터의 농도로 재현탁합니다.

후속 단계는 사용된 기질에 관계없이 동일하기 때문에 라벨링은 박테리아 세포에 대해서만 시연됩니다. 반응 혼합물을 회전 플랫폼에서 섭씨 37도에서 6시간 동안 부드럽게 혼합하여 배양합니다. 6시간 후, 반응 혼합물을 섭씨 4도 인큐베이터로 옮기고 부드럽게 혼합하면서 추가로 12시간 동안 배양합니다.

배양이 완료되면 3,000배 g에서 30분 동안 원심분리하여 염색된 기질을 수확합니다. 기판 펠릿에서 염료 용액을 디캔팅합니다. 펠릿을 유형 1의 물에 완전히 재현탁한 후 원심분리합니다. 이러한 방식으로 염료 표지 세포를 3-5회 세척하여 기질에서 비공유 결합 가용성 염료를 제거합니다.

최종 세척의 경우 염료 방출 분석에 사용될 펠릿 부분을 1.5밀리리터 미세분리기 튜브로 옮깁니다. 마지막 세척의 상청액은 투명해야 하며 기질은 파란색으로 유지되어야 합니다. 염색된 기질을 최소한의 물에 현탁시켜 사용할 준비가 될 때까지 섭씨 영하 20도에서 보관합니다.

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