박테리아 균주에서 산화 스트레스 반응을 평가하기 위한 Spot Plate Assay

파이오멜라닌과 비파이오멜라닌 생성 박테리아 균주를 모두 시험제로 처리합니다.

세포외 색소인 파이오멜라닌은 산화 스트레스로부터 보호합니다.

시험제는 농흑아닌 생합성을 방해하여 생산량을 감소시킵니다.

배양 후, 시험제 또는 비히클 용매를 포함하는 완충액으로 연속 박테리아 희석을 수행합니다.

다양한 과산화수소 농도가 있는 한천 플레이트에서 박테리아 희석액을 발견합니다 — 산화 스트레스 요인.

과산화수소가 없는 플레이트는 대조군 역할을 합니다.

인큐베이트. 대조군 플레이트에서 박테리아는 콜로니를 형성합니다.

처리되지 않은 농오멜라닌 생성 균주에서 농오멜라닌은 과산화수소로 인한 산화 손상으로부터 박테리아를 보호하여 색소 콜로니를 생성합니다.

그러나 감소된 피오멜라닌을 나타내는 시험제로 처리된 파이오멜라닌 생성 균주는 산화 스트레스에 민감해져 박테리아 사멸을 초래합니다.

식민지 수를 세십시오.

대조군보다 처리된 피오멜라닌 생성 균주와 처리되지 않은 비피오멜라닌 생성 균주 모두에서 과산화수소 농도가 증가함에 따라 콜로니 수 및 크기가 감소하는 것은 산화 스트레스에 대한 박테리아 민감도가 높아졌음을 나타냅니다.

이 절차를 시작하려면 NTBC 유무에 관계없이 LB에서 테스트할 균주의 하룻밤 배양을 설정합니다. 다음날, 산화 스트레스 요인으로 과산화수소를 함유한 LB 한천 플레이트를 준비합니다. 먼저 LB 한천 플라스크를 녹이고 배지를 실온에서 섭씨 약 50도로 식힙니다.

다음으로, 냉각된 매체에 원하는 농도로 과산화수소를 직접 첨가합니다. 플라스크를 휘젓어 섞습니다. 0에서 1밀리몰 사이의 과산화수소 농도 범위가 좋은 출발점입니다. 즉시 접시를 붓고 표면에 불을 붙여 기포를 제거합니다. 수확량은 LB 한천 100mm당 4개의 플레이트입니다. 과산화수소 농도로 플레이트를 표시합니다.

플레이트

에서 과도한 수분을 제거하기 위해 팬을 30분 동안 작동시키고 생물학적 흐름 후드에 플레이트를 덮지 않은 상태로 놓습니다. 접시는 준비된 당일에 사용해야 합니다. 플레이트가 건조되는 동안 하룻밤 배양액의 OD600을 세척하고 측정합니다.

모든 하룻밤 배양의 OD600을 테스트 중인 균주 세트의 가장 낮은 값으로 정규화합니다. 이를 위해 총 부피 1밀리리터에서 배양액을 가장 낮은 OD600으로 희석하는 데 필요한 배양액을 결정합니다.

예를 들어, 배양의 OD600이 3이고 균주 세트에 대한 가장 낮은 OD600이 2.5인 경우 다음 계산을 수행