0 조회수 • 5:10 분 • July 8th, 2025
파이오멜라닌과 비파이오멜라닌 생성 박테리아 균주를 모두 시험제로 처리합니다.
세포외 색소인 파이오멜라닌은 산화 스트레스로부터 보호합니다.
시험제는 농흑아닌 생합성을 방해하여 생산량을 감소시킵니다.
배양 후, 시험제 또는 비히클 용매를 포함하는 완충액으로 연속 박테리아 희석을 수행합니다.
다양한 과산화수소 농도가 있는 한천 플레이트에서 박테리아 희석액을 발견합니다 — 산화 스트레스 요인.
과산화수소가 없는 플레이트는 대조군 역할을 합니다.
인큐베이트. 대조군 플레이트에서 박테리아는 콜로니를 형성합니다.
처리되지 않은 농오멜라닌 생성 균주에서 농오멜라닌은 과산화수소로 인한 산화 손상으로부터 박테리아를 보호하여 색소 콜로니를 생성합니다.
그러나 감소된 피오멜라닌을 나타내는 시험제로 처리된 파이오멜라닌 생성 균주는 산화 스트레스에 민감해져 박테리아 사멸을 초래합니다.
식민지 수를 세십시오.
대조군보다 처리된 피오멜라닌 생성 균주와 처리되지 않은 비피오멜라닌 생성 균주 모두에서 과산화수소 농도가 증가함에 따라 콜로니 수 및 크기가 감소하는 것은 산화 스트레스에 대한 박테리아 민감도가 높아졌음을 나타냅니다.
이 절차를 시작하려면 NTBC 유무에 관계없이 LB에서 테스트할 균주의 하룻밤 배양을 설정합니다. 다음날, 산화 스트레스 요인으로 과산화수소를 함유한 LB 한천 플레이트를 준비합니다. 먼저 LB 한천 플라스크를 녹이고 배지를 실온에서 섭씨 약 50도로 식힙니다.
다음으로, 냉각된 매체에 원하는 농도로 과산화수소를 직접 첨가합니다. 플라스크를 휘젓어 섞습니다. 0에서 1밀리몰 사이의 과산화수소 농도 범위가 좋은 출발점입니다. 즉시 접시를 붓고 표면에 불을 붙여 기포를 제거합니다. 수확량은 LB 한천 100mm당 4개의 플레이트입니다. 과산화수소 농도로 플레이트를 표시합니다.
플레이트에서 과도한 수분을 제거하기 위해 팬을 30분 동안 작동시키고 생물학적 흐름 후드에 플레이트를 덮지 않은 상태로 놓습니다. 접시는 준비된 당일에 사용해야 합니다. 플레이트가 건조되는 동안 하룻밤 배양액의 OD600을 세척하고 측정합니다.
모든 하룻밤 배양의 OD600을 테스트 중인 균주 세트의 가장 낮은 값으로 정규화합니다. 이를 위해 총 부피 1밀리리터에서 배양액을 가장 낮은 OD600으로 희석하는 데 필요한 배양액을 결정합니다.
예를 들어, 배양의 OD600이 3이고 균주 세트에 대한 가장 낮은 OD600이 2.5인 경우 다음 계산을 수행하면 필요한 배양량으로 0.833밀리리터가 됩니다. 0.833밀리리터의 배양액을 미세분리기 튜브에 넣습니다. 다음으로, 배양량을 1밀리리터로 만드는 데 필요한 LB와 NTBC 또는 LB와 DMSO의 양을 계산합니다. 이 예에서 양은 0.167밀리리터입니다. 소용돌이로 혼합합니다.
배양을 일정한 농도의 NTBC 또는 DMSO로 유지하려면 PBS와 NTBC 또는 PBS와 DMSO에서 정규화된 하룻밤 배양을 10배 연속 희석합니다. PBS와 NTBC 및 PBS와 DMSO의 스톡 용액을 테스트한 균주 수에 따라 확장 또는 축소합니다.
한 균주에 대한 한 세트의 희석액에 대해 300마이크로몰의 NTBC 또는 이에 상응하는 부피의 DMSO를 PBS와 혼합하여 총 부피 720마이크로리터를 산출합니다. 90마이크로리터의 PBS와 NTBC 또는 PBS와 DMSO를 10에서 마이너스 1에서 10에서 마이너스 7 연속 희석액으로 표지된 적절한 미세분리기 튜브에 첨가합니다. 마이너스 1 희석 튜브에 적절한 10에 10마이크로리터의 배양액을 추가합니다.
소용돌이로 혼합하고 10 중 10 마이크로리터를 마이너스 1 희석액으로 10 마이너스 2 희석 튜브로 옮깁니다. 희석 사이에 피펫 팁을 교체하고 모든 희석이 수행될 때까지 반복합니다.
LB에 10에서 마이너스 3에서 10에서 마이너스 7 희석액 중 5마이크로리터와 각 균주에 대해 이중으로 과산화수소 플레이트를 찾습니다. 스팟이 가장 희석된 것부터 가장 희석된 것까지 도금된 경우 하나의 피펫 팁을 사용하십시오. 액체가 접시에 마를 때까지 접시를 기울이거나 기울이지 마십시오. 플레이트를 섭씨 37도에서 배양합니다. 균주에 따라 24시간에서 48시간 동안. 적당한 크기의 콜로니가 나타나면 투과조명 위의 CCD 카메라를 사용하여 플레이트를 촬영합니다.