항균제 스크리닝을 위한 Peg Plate Biofilm Assay

박테리아 생물막으로 코팅된 원통형 지지대 또는 못이 있는 뚜껑이 있는 마이크로타이터 플레이트를 가져 가십시오.

생물막 부착 측정에 초점을 맞추고 느슨하게 부착되거나 플랑크톤 박테리아를 제거하기 위해 버퍼가 있는 마이크로타이터 플레이트 웰에 생물막으로 코팅된 페그 뚜껑을 놓습니다.

헹군 생물막 코팅 페그 뚜껑을 테스트 항균제 농도를 증가시키는 챌린지 플레이트로 옮깁니다. 흔들지 않고 배양하십시오.

약제의 농도와 항균 잠재력에 따라 박테리아 대사 활동과 생물막 무결성을 방해합니다.

배양 후, 플랑크톤 박테리아를 제거하기 위해 완충액 함유 플레이트 웰에 페그 뚜껑을 놓습니다.

세포 투과성의 약한 형광 염료인 레사주린을 포함하는 생물막 회수 배지를 사용하여 마이크로타이터 플레이트 웰로 옮깁니다. 인큐베이트.

대사 활성 박테리아에서 탈수소효소 효소는 파란색 레사주린을 분홍색 형광 레소루핀으로 환원시킵니다.

레사주린 전환의 부족은 생물막 박멸을 나타내는 반면, 레소루핀으로의 전환은 생존 가능한 세포의 존재를 나타냅니다.

레사주린 전환을 생성하지 않는 가장 낮은 테스트 항균제 농도는 최소 생물막 박멸 농도를 나타냅니다.

신선한 96웰 플레이트를 가져다가 실온으로 평형화된 CRPMI 100마이크로리터를 B에서 H행 사이의 각 웰에 추가합니다. 최대 4개의 테스트 화합물을 CRPMI 1.0밀리리터에 개별적으로 희석하여 원하는 최종 농도의 2배로 희석합니다. A1 내지 A3 웰에 200 마이크로리터의 화합물 1, A4 내지 A6 웰에 200 마이크로리터의 화합물 2, A7 내지 A9에 화합물 3 200 마이크로리터, A10 내지 A12에 화합물 4 200 마이크로리터를 추가합니다.

다중 채널 피펫을 사용하여 테스트 화합물을 연속적으로 희석합니다. 먼저 100마이크로리터를 A열에서 B열로 옮기고 혼합합니다. 그런 식으로 100마이크로리터를 우물로 계속 옮깁니다. 각 전송 후 혼합하고 F 행에서 중지합니다. 혼합 후 F행에서 100마이크로리터를 쓰레기통으로 배출합니다. G열과 H열에 액체를 옮기지 마십시오. 마지막으로 다중 채널 피펫을 사용하여 플레이트의 각 웰에 100마이크로리터의 CRPMI를 추가하여 최종 부피를 200마이크로리터로 만듭니다.

200마이크로리터의 인산염 완충 식염수를 생물막 개시 플레이트와 동일한 치수의 웰을 특징으로 하는 신선한 멸균 96웰 플레이트에 추가합니다. 다음으로, 배양된 생물막 개시 플레이트에서 비닐 봉지와 파라핀 필름을 제거합니다. 뚜껑을 똑바로 들어 올리고 페그와 플레이트 바닥이 접촉하지 않도록 하면 생물막이 손상될 수 있습니다. 후속 OD₆₀₀ 해석을 위해 하단 부분을 유지합니다.

PBS가 들어 있는 플레이트에 페그 뚜껑을 올려 플랑크톤 세포를 헹굽니다. 못을 5초 동안 담그고 PBS에서 들어 올린 다음 못이 우물 측면에 부딪히지 않도록 주의하면서 다시 한 번 담그십시오. 헹군 못 뚜껑을 챌린지 플레이트에 넣습니다. 못과 바닥판 사이의 불필요한 접촉은 생물막을 손상시켜 일관되지 않은 결과를 초래할 수 있으므로 피하십시오.

판

을 파라핀 필름으로 밀봉하고 이전과 같이 밀봉 가능한 비닐 봉지에 넣습니다. 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 24시간 동안 흔들지 않고 플레이트를 배양합니다. 생물막 개시 플레이트의 바닥을 가져다가 다중 채널 피펫을 사용하여 각 웰의 박테리아를 재현탁합니다. 적절한 마이크로플레이트 리더로 OD₆₀₀을 측정하여 모든 웰에서 발생하는 성장을 확인하지만 무균 제어는 행 H에서 확인합니다.

배양 챔버가 장착되어 있고 레사주린 전환을 검출하기 위해 동역학 형광 판독값을 얻을 수 있는 플레이트 리더를 사용하십시오. 530나노미터 여기와 590나노미터 방출을 사용하여 24시간 동역 형광 측정을 설정합니다. 챔버 온도를 섭씨 37도로 설정하고 20분마다 플레이트를 읽습니다.

제조업체의 지침에 따라 플레이트 바닥에서 측정하도록 플레이트 리더를 설정합니다. 다중 채널 피펫을 사용하여 멸균 96웰 플레이트의 각 웰에 200마이크로리터의 PBS를 추가하여 플레이트를 세척할 준비를 합니다. 그런 다음 밀리리터당 0.8밀리그램의 레사주린 원액 400마이크로리터를 CRPMI 배지 20밀리리터에 첨가하여 밀리리터당 레사주린당 16마이크로그램의 최종 농도가 되도록 하여 생물막 회수 배지를 준비합니다.

다음으로, 다중 채널 피펫을 사용하여 150마이크로리터의 생물막 회수 배지를 신선한 96웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 챌린지 플레이트를 인큐베이터에서 생물 안전 캐비닛으로 옮기고 비닐 봉지와 밀봉 필름을 조심스럽게 제거합니다. 챌린지 플레이트에서 페그 뚜껑을 제거하고 이전과 같이 PBS에서 플랑크톤 세포를 헹구고 후속 OD₆₀₀ 분석을 위해 챌린지 플레이트의 바닥을 유지합니다.

헹

군 후 페그 뚜껑을 생물막 회수 배지가 들어 있는 플레이트 바닥에 놓습니다. 플레이트 측면을 파라핀 필름으로 감싸고 주변 우물의 바닥을 막지 않도록 주의하십시오. 플레이트를 포장한 직후 플레이트 리더기에 놓고 이전에 만든 레사주린 키네틱 프로토콜을 시작하여 24시간 동안 키네틱 판독을 시작합니다.