0 조회수 • 4:34 분 • July 8th, 2025
얼음 위에 포유류 세포가 들어 있는 마이크로플레이트를 가져 가십시오.
선택한 웰에 칼슘이 함유된 배지를 추가하고 칼슘이 없는 배지를 다른 웰에 추가합니다.
박테리아 기공 형성 독소의 단량체를 도입합니다. 낮은 온도는 단량체 응집을 방지하여 세포막 콜레스테롤과의 결합을 촉진합니다.
생리학적 온도에서 배양하여 콜레스테롤 결합 단량체가 올리고머화되어 막에 삽입되어 기공을 형성할 수 있도록 합니다.
세포외 칼슘이 있는 우물에서는 기공이 칼슘 유입을 일으킵니다.
유입은 독소의 엑소좀 배출과 막 재밀봉을 유발합니다.
세포내 칼슘 증가는 또한 리소좀 엑소사이토시스를 유도하여 막의 스핑고미엘린을 세라마이드로 전환하는 효소를 방출합니다.
세라마이드가 풍부한 막은 독소 엔도사이토시스를 유발하여 막을 다시 밀봉합니다.
세포외 칼슘이 없는 우물에서는 막 재밀봉이 방해됩니다.
요오드화 프로피듐 또는 PI(형광 염료)를 첨가하면 막이 복구된 세포에 들어갈 수 없지만 손상된 세포에 들어가 DNA에 결합하여 형광을 방출합니다.
멤브레인 재밀봉 효율을 평가하기 위해 정의된 간격으로 형광을 측정합니다.
복구 허용 조건에 대한 고처리량 형광 기반 분석을 설정하기 위해, 웰당 섭씨 37도 M1 배지 200마이크로리터로 세포를 2회 세척하고, 두 번째 세척을 폐기한 후 30마이크로몰 요오드화 프로피듐이 보충된 신선한 섭씨 37도 M1 배지 100마이크로리터를 추가합니다.
복구 제한 조건의 경우, 웰당 5밀리몰 EGTA가 보충된 섭씨 37도 M2 배지 200마이크로리터로 세포를 한 번 세척한 후 200마이크로리터의 M2 배지 단독으로 한 번 세척합니다.
두 번째 세척을 버린 후, 웰당 30마이크로몰 요오드화 프로피듐이 보충된 신선한 섭씨 37도 M2 배지 100마이크로리터를 첨가합니다. 그런 다음 방금 설명한 대로 투과광, GFP 및 PI 아래에서 플레이트를 이미지화합니다. 플레이트를 이미지화하는 동안 96웰 둥근 바닥 폴리프로필렌 마이크로플레이트를 얼음 위에 놓고 이전 플레이트에 대해 방금 시연한 대로 플레이트를 구성합니다.
수리 허용 조건의 경우, 웰당 60마이크로몰 프로피듐 요오드화물이 보충된 얼음처럼 차가운 M1 배지 100마이크로리터를 첨가한 다음, 웰당 4x 리스테리올리신 O를 포함하거나 포함하지 않는 얼음처럼 차가운 M1 100마이크로리터를 첨가합니다.
수리 제한 조건의 경우, 웰당 60마이크로몰 프로피듐 요오드화물이 보충된 얼음처럼 차가운 M2 배지 100마이크로리터를 첨가한 다음, 웰당 4x 리스테리오리신 O를 포함하거나 포함하지 않는 얼음처럼 차가운 M2 100마이크로리터를 첨가합니다.
플레이트 1이 얼음 위에 있고 플레이트 2가 준비될 때 동역학 분석 시작 약 5분 전에 얼음 위에 적절한 실험 농도로 리스테리오리신 O를 준비하는 것이 필수적입니다.
첫 번째 플레이트 이미징이 완료되면 즉시 얼음 위의 알루미늄 호일 시트에 플레이트를 옮깁니다. 5분 후, 두 번째 플레이트의 각 웰에서 첫 번째 냉각된 플레이트의 적절한 해당 웰로 100마이크로리터를 옮기고, 독소의 적절한 분포를 위해 혼합하지 않고 부피를 배출하기 전에 각 웰의 용액 메니스커스 아래에 피펫 팁을 삽입합니다.
독소가 숙주 세포에 1분 동안 결합하도록 한 다음 분광형광계 모드를 사용하여 사후 동위 분석을 위해 첫 번째 플레이트를 플레이트 리더로 즉시 옮깁니다. 동역학 분석이 끝나면 운동 전 이미징에 대해 입증된 바와 같이 플레이트 이미지의 사후 운동 이미징을 즉시 획득합니다.