광견병 바이러스 항원 검출을 위한 면역조직화학 염색

포르말린 고정, 파라핀 포매 광견병 바이러스에 감염된 마우스 뇌 조직 절편을 운반하는 슬라이드로 시작합니다. 고정 섹션은 단백질 가교를 통해 바이러스 항원을 유지합니다.

슬라이드를 자일렌 용액으로 처리하여 파라핀을 제거합니다.

슬라이드를 감소하는 에탄올 농도에 담그면 조직에 수분이 공급되어 수용액과 호환

단백질 가교를 방해하기 위해 프로테아제 함유 완충액을 도입하여 항원 접근성을 개선합니다.

과산화수소에 담가 내인성 과산화효소를 차단하고 차단 용액을 적용하여 비특이적 상호 작용을 방지합니다.

광견병 항원에 특이적인 1차 항체를 도입하여 항원-항체 복합체를 형성합니다.

1차 항체에 결합하는 비오티닐화된 2차 항체를 추가합니다. 비오틴과 상호 작용하는 스트렙타비딘 접합 과산화효소 효소와 함께 배양합니다.

과산화효소 기질을 도입하여 자홍색 침전물을 생성합니다.

핵 염색제로 조직을 대조염색한 다음 블루잉제를 사용하여 핵을 파란색으로 염색합니다.

면역조직화학 이미지는 세포질에 자홍색 반점을 나타내어 조직 절편에 광견병 항원의 존재를 확인합니다.

마이크로톰을 사용하여 5마이크로미터 파라핀 절편을 만듭니다. 섭씨 38도의 수조에 절편을 띄우고 유리 슬라이드에 모으십시오. 시약 내성 펜으로 슬라이드에 라벨을 붙입니다. 슬라이드를 트레이에 놓고 섭씨 55-60도의 오븐에서 1시간 동안 녹입니다.

그런 다음 오븐에서 슬라이드를 꺼내고 각각 5분씩 3회 연속 자일렌 헹굼을 사용하여 즉시 탈파라핀화합니다. 그 후, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 탈이온수로 에탄올의 희석액을 감소시키는 순차적으로 담가 슬라이드의 섹션을 재수화합니다.

단백질 분해 항원 회수를 위해 슬라이드를 프로테아제로 30분 동안 처리한 다음 PBST에서 슬라이드를 10분 동안 헹구고 3% 과산화수소로 10분 동안 처리합니다. 그런 다음 슬라이드를 PBST로 10분 동안 다시 세척합니다.

시작하려면 완충액에서 슬라이드 하나를 제거하고 한 번에 하나의 슬라이드만 처리하고 나머지는 물에 잠긴 상태로 유지하고 종이 타월을 사용하여 조직 절편 주변의 과도한 완충액을 닦아냅니다. 슬라이드를 습도 챔버에 넣고 실온에서 일반 염소 혈청과 함께 15분 동안 배양합니다.

다음으로, 최적의 미리 결정된 희석액 1차 항광견병 항체 및 음성 대조군 항체와 함께 습도 챔버에서 슬라이드를 실온에서 60분 동안 세척하지 않고 배양합니다. 그 후, 슬라이드를 PBST로 10분 동안 세척하고, 비오티닐화 항체와 함께 습도 챔버에서 실온에서 15분 동안 배양한다.

슬라이드를 PBST로 10분 동안 다시 세척합니다. 슬라이드를 스트렙타비딘-HRP 복합체와 함께 습도 챔버에서 실온에서 15분 동안 배양하고 PBST를 10분 동안 세척합니다. 그런 다음 실온의 습도 챔버에서 AEC와 함께 10분 동안 배양합니다. 슬라이드를 탈이온수로 10분 동안 세척하고 탈이온수로 1 내지 2로 희석한 Gill's 헤마트실린으로 2분 동안 대조염색합니다.

그런 다음 슬라이드를 탈이온수에 담그고 헹구어 과도한 헤마트실린을 헹굽니다. 슬라이드를 Scott의 수돗물로 30초 동안 헹구고 탈이온수로 10분 동안 세척합니다. 슬라이드를 한 번에 하나씩 제거하고 수용성 장착 매체로 장착합니다. 그런 다음 광학 현미경을 사용하여 슬라이드를 읽습니다.