마우스 고환에서 단백질 결합 RNA의 효율적인 식별을 위한 향상된 교차결합 면역침전 방법

갓 수확한 마우스 고환을 차갑게 식힌 완충액에 넣으십시오. 섬유 조직층인 tunica albuginea를 제거합니다.

고환을 분쇄하여 생식과 Sertoli 세포를 포함하는 정세관을 방출합니다.

완충액을 첨가하고 세뇨관에 UV 방사선을 가하여 RNA와 관련 단백질의 비가역적 가교를 통해 상호 작용을 보존합니다.

원심분리하여 상청액을 버립니다.

RNase 및 프로테아제 억제제를 포함하는 용해 완충액에 세뇨관을 재현탁합니다.

조직을 초음파 처리하여 단백질-RNA 복합체 및 기타 세포내 성분을 방출합니다. RNase 및 프로테아제 억제제는 내인성 RNase 및 프로테아제를 비활성화합니다.

DNase를 첨가하여 DNA를 분해합니다. 부분 RNA 소화를 위해 희석된 RNase를 도입합니다.

RNA-단백질 복합체를 함유한 상청액을 원심분리하여 표적 RNA 결합 단백질에 대한 특이성이 높은 항체 코팅 마그네틱 비드 용액으로 옮깁니다.

자기장을 적용하여 비드 결합 단백질-RNA 복합체를 분리합니다. 상청액을 버리십시오.

완충액으로 씻으십시오. 단백질-RNA 복합체를 자기적으로 분리하여 추가 RNA-단백질 상호작용 분석에 사용합니다.

이 절차를 시작하려면 각 면역침전 실험을 위해 적절한 연령의 마우스로부터 약 100mg의 고환을 수확합니다. 얼음처럼 차가운 PBS에 티슈를 넣습니다. 끝이 가는 핀셋을 사용하여 백막을 부드럽게 제거합니다. 얼음처럼 차가운 PBS 3밀리리터를 티슈 그라인더에 넣고 느슨한 유리 유봉을 사용하여 약한 기계적 힘으로 티슈를 분쇄합니다. 다음으로, 조직 현탁액을 세포 배양 접시로 옮기고 최대 6밀리리터의 얼음처럼 차가운 PBS를 첨가합니다. 액체가 접시 바닥을 고르게 덮도록 접시를 빠르게 흔듭니다.

얼음 위의 현탁액을 254나노미터에서 제곱센티미터당 400밀리줄로 세 번 가교합니다. 각 조사 사이에 현탁액을 혼합한 다음 현탁액을 15밀리리터 원추형 튜브에 모아 1,200배g, 4도에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 제거하고 펠릿을 PBS 1밀리리터에 재현탁합니다. 그런 다음 현탁액을 1.5밀리리터 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 1,000배 g, 섭씨 4도에서 2분 동안 원심분리하고 상층액을 버린다.

먼저, 샘플당 125마이크로리터의 단백질 A 마그네틱 비드를 신선한 원심분리기 튜브에 추가합니다. 튜브를 자석 위에 올려 용액에서 비드를 분리합니다. 10초 후 상청액을 제거하고 얼음처럼 차가운 용해 완충액