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면역학
0 조회수 • 6:20 분 • July 8th, 2025
서로 다른 세포 주기 단계에서 항원 특이적 CD8+ T 세포를 포함하는 항원 면역 마우스로부터 2차 림프 기관 세포를 채취합니다.
G1, S, G2 및 M은 활발하게 분열하는 세포 단계인 반면 G0 단계의 세포는 정지 상태입니다.
죽은 세포를 표지하기 위해 형광 생존율 염료를 추가하고 T 세포 표면 마커 CD3 및 CD8에 결합하는 형광단 태그 항체를 추가합니다.
형광단 접합 항원 펩타이드-MHC 다량체를 도입하여 T 세포 수용체에 결합하여 항원 특이적 T 세포를 표지합니다.
완충액을 사용하여 세포를 고정하고 투과시킵니다.
형광단 태그가 부착된 항체를 도입하여 세포 증식 관련 핵 단백질에 결합하여 활발하게 분열하는 세포를 염색합니다.
DNA를 표지하기 위해 형광 염색을 추가합니다.
유세포 분석을 사용하여 살아있는 세포를 선택하고 표면 결합 라벨을 통해 항원 특이적 CD8+ T 세포를 식별합니다.
DNA 염색 강도는 DNA 양이 적은 G0 및 G1 세포와 DNA 양이 많은 S, G2 및 M 세포를 구별합니다. 핵 단백질 특이적 항체가 없으면 G0 세포가
분리됩니다.10X 투과화 완충액을 증류수로 희석하여 신선한 1X 투과화 세척 완충액을 준비하고 0.45마이크로미터 필터를 통해 여과하여 응집체를 제거합니다. 단클론 항체 Ki67-FITC를 1X 투과화 세척 완충액에 희석하여 샘플당 100마이크로리터의 최종 부피에 대한 적정 실험으로 결정합니다.
세포가 있는 각 튜브에 1X 투과화 세척 완충액 3밀리리터를 넣고 실온에서 5분 동안 400g에서 원심분리합니다. 상청액을 버리십시오. 다시 1X 투과화 세척 완충액을 첨가하고 원심분리하여 세포를 펠릿화한 다음 상청액을 버립니다.
100마이크로리터의 희석된 단클론 항체 Ki67-FITC를 펠릿에 첨가한 다음 소용돌이치고 어두운 곳에서 30분 동안 배양합니다. 배양 후, 세포를 4밀리리터의 1X 투과화 완충액으로 두 번 세척하고 각 세척 후 원심분리하고 상청액을 버립니다.
유세포 분석기에서 직접 샘플을 획득하기 위해 세포 펠릿에 350마이크로리터의 PBS를 추가하고, DNA 염색을 위해 Hoechst와 함께 배양할 샘플을 위해 세포 펠릿에 250마이크로리터의 PBS를 추가합니다. Hoechst 및 PBS 용액을 준비하여 각 샘플에 첨가하여 최종 농도가 밀리리터당 2마이크로그램이 되도록 합니다. 소용돌이치고 어둠 속에서 15분 동안 샘플을 배양합니다. 그런 다음 샘플을 5분 동안 원심분리하고 350마이크로리터의 PBS를 세포 펠릿에 첨가합니다.
소프트웨어를 열고 작업 공간 리본 섹션에서 그룹 만들기를 클릭하여 분석할 다른 기관에 해당하는 다른 그룹을 만듭니다. 그룹 이름을 두 번 클릭하여 그룹 수정 창을 열고 동기화됨 함수에 확인 표시를 삽입하여 새로 생성된 그룹을 동기화합니다.
각 FCS 파일을 해당 그룹으로 드래그한 다음 LN 그룹을 통해 시작하는 게이팅 전략을 생성합니다. 완전히 염색된 샘플을 두 번 클릭하여 그래프 창을 열어 이 샘플에 대해 획득한 unated 이벤트를 도트 플롯으로 표시합니다. x 및 y축은 이 원고의 유세포 분석기 설정 파일의 표 2에 표시된 대로 FCS 파일에서와 같이 레이블이 지정되어 있습니다. 적절한 시각화를 위해 충분한 수의 이벤트가 표시되는지 확인합니다.
필요한 경우 작업 공간 리본에서 하트 아이콘을 클릭하여 기본 설정을 열고 그래프를 선택한 다음 도트 플롯을 그래프 유형으로 선택한 다음 해당 상자에 그려진 점 수가 올바른지 확인하거나 변경합니다. 그래프 창에 없는 이벤트를 x축에 DNA-A, y축에 DNA-W를 사용하여 도트 플롯으로 표시합니다. 두 축 모두에 선형 스케일을 사용합니다. 필요한 경우 그래프 창에서 각 축에 가까운 T로 표시된 상자를 클릭하여 배율을 로그에서 선형으로 변경합니다.
게이팅 도구 섹션에서 직사각형을 클릭하여 단일 세포 집단을 선택한 다음 직사각형 게이트의 중앙을 두 번 클릭하여 x축에 FSC-A 매개변수가 있고 y축에 데드 셀 염료가 있는 도트 플롯에 단일 셀을 표시합니다.
다각형을 클릭하여 죽은 세포 염료에 대해 음성인 살아있는 세포 집단을 선택합니다. 다각형 게이트의 중앙을 두 번 클릭하면 x축에 FSC-A 매개변수가 있고 y축에 SSC-A 매개변수가 있는 도트 플롯에 셀이 표시됩니다.
Rectangle을 클릭하고 해당 그래프에 모든 단일 라이브 셀을 포함하는 "완화된" 게이트를 만듭니다. 이완된 게이트의 중앙을 두 번 클릭하여 x축에 CD3, y축에 CD8이 있는 도트 플롯에 세포를 표시합니다.
그래프 창에서 시각화를 위해 적절한 축 스케일을 사용합니다. 필요한 경우 각 축에 가까운 T로 표시된 상자를 클릭하여 x 및 y 눈금을 수정합니다. 축 함수 사용자 정의를 선택하고 필요에 따라 추가 음수 10년, 너비 기준 및 양수 10년을 수정합니다.
다각형을 클릭하여 CD3 양성, CD8 양성 세포를 선택합니다. CD3 양성, CD8 양성 게이트의 중앙을 두 번 클릭하여 x축에 Tetr-gag, y축에 Pent-gag가 있는 도트 플롯에 세포를 표시합니다. Polygon을 클릭하여 항원 특이적 CD8 T 세포를 선택합니다. 개그 특이적 게이트의 중앙을 두 번 클릭하면 x축에 DNA-A가 있고 y축에 Ki67이 있는 도트 플롯에 세포가 표시됩니다. 그래프 창의 게이팅 도구 섹션에서 쿼드를 클릭하여 다른 세포 주기 단계의 세포를 선택합니다.