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면역학
0 조회수 • 6:20 분 • July 8th, 2025
서로 다른 세포 주기 단계에서 항원 특이적 CD8+ T 세포를 포함하는 항원 면역 마우스로부터 2차 림프 기관 세포를 채취합니다.
G1, S, G2 및 M은 활발하게 분열하는 세포 단계인 반면 G0 단계의 세포는 정지 상태입니다.
죽은 세포를 표지하기 위해 형광 생존율 염료를 추가하고 T 세포 표면 마커 CD3 및 CD8에 결합하는 형광단 태그 항체를 추가합니다.
형광단 접합 항원 펩타이드-MHC 다량체를 도입하여 T 세포 수용체에 결합하여 항원 특이적 T 세포를 표지합니다.
완충액을 사용하여 세포를 고정하고 투과시킵니다.
형광단 태그가 부착된 항체를 도입하여 세포 증식 관련 핵 단백질에 결합하여 활발하게 분열하는 세포를 염색합니다.
DNA를 표지하기 위해 형광 염색을 추가합니다.
유세포 분석을 사용하여 살아있는 세포를 선택하고 표면 결합 라벨을 통해 항원 특이적 CD8+ T 세포를 식별합니다.
DNA 염색 강도는 DNA 양이 적은 G0 및 G1 세포와 DNA 양이 많은 S, G2 및 M 세포를 구별합니다. 핵 단백질 특이적 항체가 없으면 G0 세포가
분리됩니다.10X 투과화 완충액을 증류수로 희석하여 신선한 1X 투과화 세척 완충액을 준비하고 0.45마이크로미터 필터를 통해 여과하여 응집체를 제거합니다. 단클론 항체 Ki67-FITC를 1X 투과화 세척 완충액에 희석하여 샘플당 100마이크로리터의 최종 부피에 대한 적정 실험으로 결정합니다.
세포가 있는 각 튜브에 1X 투과화 세척 완충액 3밀리리터를 넣고 실온에서 5분 동안 400g에서 원심분리합니다. 상청액을 버리십시오. 다시 1X 투과화 세척 완충액을 첨가하고 원심분리하여 세포를 펠릿화한 다음 상청액을 버립니다.
100마이크로리터의 희석된 단클론 항체 Ki67-FITC를 펠릿에 첨가한 다음 소용돌이치고 어두운 곳에서 30분 동안 배양합니다. 배양 후, 세포를 4밀리리터의 1X 투과화 완충액으로 두 번 세척하고 각 세척 후 원심분리하고 상청액을 버립니다.
유세포 분석기에서 직접 샘플을 획득하기 위해 세포 펠릿에 350마이크로리터의 PBS를 추가하고, DNA 염색을 위해 Hoechst와 함께 배양할 샘플을 위해 세포 펠릿에 250마이크로리터의 PBS를 추가합니다. Hoechst 및 PBS 용액을 준비하여 각 샘플에 첨가하여 최종 농도가 밀리리터당 2마이크로그램이 되도록 합니다. 소용돌이치고 어둠 속에서 15분 동안 샘플을 배양합니다. 그런 다음 샘플을 5분
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