DNA 기반 장력 프로브를 사용하여 면역 세포가 가하는 수용체 힘 평가

폴리에틸렌 글리콜 고정 금 나노입자가 있는 기능성 유리 커버슬립으로 시작하십시오.

반대쪽 팔에 두 개의 올리고뉴클레오티드와 혼성화된 DNA 헤어핀을 포함하는 DNA 헤어핀 장력 프로브를 추가합니다.

리간드 가닥에는 형광단과 비오틴이 포함되고, 앵커 가닥에는 소멸제와 티올 그룹이 포함되어 있습니다. 이 설정에서 소광제는 형광을 억제합니다.

DNA 프로브는 금 나노입자에 결합하여 유리 커버슬립에 고정됩니다.

리간드 가닥의 비오틴 분자와 상호 작용하는 스트렙타비딘을 도입합니다.

사전 결합된 스트렙타비딘 분자에 결합하는 비오티닐화 리간드를 추가합니다.

커버슬립에 CD8 양성 T 세포를 오버레이합니다. 이들의 수용체는 고정된 리간드와 상호 작용하여 수용체-리간드 상호 작용 부위를 형성합니다.

이러한 상호 작용은 DNA 헤어핀 구조를 펼치는 힘을 생성하여 형광단을 소광제에서 분리하고 형광 방출을 촉진합니다.

형광 신호를 보존하기 위해 프로브의 펼쳐진 세그먼트와 상호 작용하는 비형광 잠금 가닥을 도입합니다.

면역 세포에 의해 가해지는 수용체력을 평가하기 위해 형광을 정량화합니다.

시작하려면 50밀리리터 비커에 폴리테트라플루오로에틸렌 랙에 25mm 커버슬립을 놓고 커버슬립을 물에 담가 세 번 헹굽니다. 같은 양의 에탄올과 물을 혼합하고 랙과 커버슬립이 들어 있는 비커에 이 용액 40밀리리터를 추가합니다. 그런 다음 파라필름 테이프를 사용하여 비커를 밀봉합니다.

초음파 세척기에서 비커를 15 분 동안 초음파 처리하여 커버 슬립을 청소하고 초음파 처리 후 액체를 버립니다. 그런 다음 랙과 커버슬립이 들어 있는 비커를 물로 최소 6회 헹구어 남아 있는 유기 용매를 제거합니다. 신선한 피라냐 용액을 준비하려면 50밀리리터 비커에 황산 30밀리리터를 넣고 과산화수소 10밀리리터를 천천히 첨가합니다. 유리 피펫 끝을 사용하여 피라냐 용액을 부드럽게 혼합합니다.

에칭을 시작하려면 커버슬립을 고정하는 랙을 피라냐 용액이 들어 있는 비커로 옮기고 실온에서 30분 동안 배양하여 커버슬립을 세척하고 수산화합니다. 그런 다음 강철 또는 폴리테트라플루오로에틸렌 핀셋을 사용하여 랙을 깨끗한 50밀리리터 비커로 옮기고 물로 6번 헹굽니다. 물을 완전히 제거하려면 커버슬립을 고정하는 랙을 40밀리리터의 에탄올이 담긴 50밀리리터 비커에 담근 다음 에탄올을 버립니다.

다음으로, 랙을 실온에서 1시간 동안 3% 아미노프로필 트리에톡시 실란을 함유한 에탄올 40밀리리터에 담가 커버슬립의 수산기와의 반응을 시작합니다. 커버슬립의 표면을 에탄올 40밀리리터에 담가 6회 헹구고 섭씨 80도의 오븐에서 20분간 건조

페트리 접시의 내부 바닥을 파라필름 테이프로 덮어 커버슬립이 페트리 접시 내부로 미끄러지는 것을 방지합니다. 그런 다음 아민으로 덮인 커버슬립을 DNA 장력 프로브가 위를 향하도록 기능화할 면을 놓습니다. 나중에 사용할 수 있도록 커버슬립을 섭씨 영하 20도에서 덮으십시오.

커버슬립의 아민 그룹을 변형하려면 리포산-PEG-NHS 및 mPEG-NHS를 첨가하고 페트리 접시를 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 표면을 물로 세 번 헹굽니다. 그 후, Sulfo-NHS-아세테이트 밀리리터당 1mg을 함유한 0.1몰 중탄산나트륨 100마이크로리터를 샌드위치 커버슬립 세트에 첨가하고 부동태화가 일어날 때까지 30분 동안 배양합니다.

각 커버슬립에 0.5밀리리터의 금 나노입자를 첨가하고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 배양 후 커버슬립을 물로 세 번 헹굽니다. 어닐링된 DNA 장력 프로브에 블랙홀 소광제 2 가닥을 10:1 비율로 첨가한 후, 커버슬립 2개당 혼합물 100마이크로리터를 첨가하여 샌드위치를 만듭니다.

젖은 실험실 티슈 볼을 커버슬립에서 멀리 떨어진 페트리 접시에 조심스럽게 놓고 용액이 마르지 않도록 파라필름 테이프로 접시를 밀봉합니다. 그런 다음 접시를 호일로 덮고 섭씨 4도에서 밤새 배양합니다. 다음날, 챔버를 조이는 동안 표면 균열을 방지하도록 주의하면서 이미징 챔버를 조립합니다. 그런 다음 0.5-1밀리리터의 행크 균형 염 용액을 이미징 챔버에 추가합니다.

100x 대물렌즈와 함께 Cy3B 채널을 사용하여 DNA 헤어핀 장력 프로브에 도금된 세포가 퍼지기 시작할 때 세포의 형광 신호를 캡처합니다. 100마이크로몰 비형광 잠금 가닥 스톡을 준비한 후, 원하는 시점에 이미징 챔버에서 최종 농도 1마이크로몰로 세포에 첨가하여 장력 신호를 저장하고 피펫팅으로 세포와 혼합합니다.

약 10분 동안 잠긴 후 정성적 장력 매핑 및 정량적 분석을 위해 반광형광으로 타임랩스 동영상 또는 종점 이미지를 획득합니다.