감염된 마우스에서 배출 림프절로의 피부 수지상 세포 이동을 모니터링하기 위한 CFSE 기반 분석

마취된 마우스를 예로 들어 보겠습니다. Mycobacterium bovis BCG 현탁액을 뒷발바닥에 주입합니다.

피부 수지상 세포는 마이코박테리아를 인식하고 식균합니다.

또한, 처리된 마이코박테리아 성분은 MHC 클래스 II 분자에 제시됩니다.

세포 투과성 CFSE 염료를 동일한 발판에 주입합니다.

세포내 에스테라아제는 CFSE를 세포 불투과성 형광 산물로 절단하여 세포를 염색합니다.

또한, 활성화된 수지상 세포는 림프관을 통해 슬와 림프절로 이동하여 T 세포를 활성화합니다.

슬와 림프절을 외과적으로 절제하고 여과기를 통해 균질화하여 단일 세포 현탁액을 얻습니다.

세포를 원심분리하고 완충액에 재현탁합니다.

세포를 유세포 분석 튜브로 옮깁니다. 원심분리하고 항체 칵테일로 세포를 처리합니다.

Fc 차단 항체는 Fc 수용체를 차단하는 반면, 형광단 태그 항체는 면역 세포의 표면 마커 CD11c 및 MHC 클래스 II 분자에 결합합니다.

유세포 분석을 사용하여 MHC-II가 높고 CD11c 발현이 낮은 CFSE 표지 피부 수지상 세포를 식별하여 림프절로의 이동을 확인합니다.

마이코박테리움 소 BCG 주사의 경우, 발가락 꼬집기로 적절한 진정 수준을 확인한 후, 29게이지 반인치 바늘이 장착된 주사기를 사용하여 8-12주 생후 마우스의 뒷발판에 박테리아의 1 x 10⁶ 콜로니 형성 단위와 30마이크로리터의 PBS를 접종합니다. PBS만 사용하여 제어 발판을 삽입합니다. 그런 다음 동물이 완전히 누워서 주입된 발판에 체중을 실을 수 있을 때까지 동물을 모니터링합니다.

CFSE 주사의 경우 BCG 주사 후 적절한 시점에서 실온 5밀리몰 CFSE 바이알을 PBS에서 10배 희석하고 용액을 완전히 재현탁하도록 주의합니다. 그런 다음 주사기에 희석된 CFSE를 넣고 첫 번째 주사를 받은 동일한 뒷발 패드에 20마이크로리터를 투여합니다. CFSE 주사 후 24시간 후 허벅지 뒤쪽을 조심스럽게 수직으로 절개하고 근육 지방을 제거합니다.

다음으로, 가위와 핀셋을 사용하여 무릎 움푹 들어간 지방 주머니 깊숙한 곳에 위치한 슬와 림프절을 노출하고 절제합니다. 림프절을 얼음 위의 멸균 PBS 0.5밀리리터로 옮기고, 3밀리리터 주사기의 백엔드와 함께 5밀리리터의 PBS가 포함된 6웰 플레이트의 한 웰 내부에 있는 70미크론 세포 여과기를 통해 림프절을 균질화합니다. 여과기를 다른 5밀리리터의 완충액으로 세척하고 세포 용액을 15밀리리터