비드 지지 지질 이중층을 활용하여 T 세포의 시냅스 출력 조사

비드 지지 지질 이중층(BSLB), 항원 펩타이드-MHC 복합체, 접착 및 공동 자극 분자와 접합된 지질 이중층으로 코팅된 실리카 비드를 사용하여 합성 항원 제시 세포로 작용합니다.

T 세포와 함께 배양합니다.

TCR은 BSLB의 항원 펩타이드에 결합하며, 이는 공동 자극 신호와 함께 면역 시냅스를 형성하여 T 세포를 활성화합니다.

이 결합은 세포 내 신호 전달 캐스케이드를 유발하여 액틴 재배열을 유도하고 접착 및 신호 분자를 포함하는 시냅스에서 마이크로클러스터를 형성합니다.

T 세포는 TCR, 공동 자극 분자 및 용해 과립 내용물이 풍부한 시냅스 전소를 시냅스로 방출하여 BSLB에 결합합니다.

T 세포에서 BSLB를 분리하기 위해 공동 배양을 점차적으로 식힙니다.

원심분리하여 상청액을 버립니다. 단백질 함유 완충액을 사용하여 표면의 자유 결합 부위를 차단합니다.

BSLB 및 T 세포를 특정 신호 전달 및 공동 자극 분자에 결합하는 형광단 접합 항체로 원심분리하고 처리합니다.

유세포 분석을 사용하여 BSLB 및 T 세포의 형광 신호를 분석하여 시냅스 출력을 정량화합니다.

웰당 500,000 BSLB를 200마이크로리터의 HBS/HSA 완충액에 재현탁합니다. 웰당 100마이크로리터의 BSLB를 새로운 U-바닥 96웰 플레이트로 옮겨 복제하여 웰당 BSLB의 최종 양이 250,000이 되도록 합니다. BSLB를 실온에서 2분 동안 300배 g으로 회전시킵니다. 상청액을 버린 다음 100마이크로리터의 T 세포 현탁액을 사용하여 BSLB를 재현탁합니다. 거품이 생기지 않도록 부드럽게 섞어주세요. 섭씨 37도에서 90분 동안 공동 배양

을 배양합니다.

세포를 빛으로부터 보호하고 먼저 실온에서 최소 15분 동안 배양하여 공동 배양을 식힙니다. 공동 배양을 실온에서 500배 g에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 버리고 실온에서 칼슘 및 마그네슘 이온이 없는 2% BSA-PBS에 공동 배양을 재현탁하여 차단합니다. 세포를 얼음 위에 45분 동안 놓고 빛으로부터 보호합니다.

얼

음처럼 차가운 0.22마이크로미터 여과된 2% BSA 및 PBS를 염색 완충액으로 사용하여 항체 마스터 믹스를 준비합니다. 이 마스터 믹스는 추가 차단을 제공합니다. 공동 배양을 500배 g에서 섭씨 5분 동안 4도 동안 회전시킵니다. 상청액을 버린 다음 다중 채널 피펫을 사용하여 최적화된 항체 농도를 포함하는 스탠딩 마스터 믹스에 세포를 재현탁합니다