감염된 1차 대식세포에서 세포질 및 진공 살모넬라균을 정량화하기 위한 분석
JoVE 실험 백과사전
면역학
0 조회수 • 6:27 분 • July 8th, 2025
골수 유래 대식세포 배양을 취하십시오. 배지를 제거하고 형광 세포질 단백질을 발현하는 살모넬라 박테리아를 첨가합니다.
박테리아-대식세포 접촉을 용이하게 하기 위해 원심분리하고 배양합니다.
박테리아는 대식세포 수용체에 결합하여 식체 내부의 내재화를 촉진합니다.
포작용은 엔도좀 유래 소포와 융합하고 동시에 박테리아는 이펙터를 분비하여 식체를 살모넬라 함유 액포 또는 SCV로 리모델링합니다.
SCV의 하위 집합이 파열되어 내재화된 박테리아가 세포질로 방출됩니다.
내재되지 않은 박테리아를 제거하기 위해 항생제를 첨가하십시오. 죽은 박테리아가 포함된 배지를 흡인합니다.
콜레스테롤에 결합하는 세제 디지토닌을 함유한 완충액을 도입합니다.
콜레스테롤이 풍부한 원형질막에 결합하는 디지토닌은 기공 형성을 초래하는 반면, 콜레스테롤이 결핍된 SCV 막은 손상되지 않은 상태로 유지되며, 이를 차등 투과화라고 합니다.
투과화된 세포에 들어가 세포질 박테리아에 결합하는 형광 표지 항체를 추가합니다.
세제를 사용하여 세포와 SCV를 용해하여 내재화된 모든 박테리아를 방출합니다.
유세포 분석을 사용하여 이중 염색된 세포질 박테리아와 단일 염색된 액포 박테리아를 정량화합니다.
감염 하루 전에 스트렙토마이신과 암피실린이 보충된 Luria-Bertani 배지 3밀리리터에 박테리아 균주를 섭씨 37도의 셰이커에서 밤새 접종합니다. 개별 조건을 설명하기 위해 대조군으로 사용할 24웰 플레이트의 웰에 커버슬립을 추가합니다.
감염을 위해 세포를 플레이트화하려면 1밀리리터의 1차 대식세포 배지에 웰당 0.125,5천 개의 세포 밀도로 야생형 골수 유래 대식세포 또는 BMDM을 공급합니다. 그런 다음 섭씨 37도 및 이산화탄소 5%의 인큐베이터에서 세포를 밤새 배양합니다.
다음날, 인산염 완충 식염수에 대해 희석된 배양물의 600나노미터 또는 OD600에서 광학 밀도를 측정하여 하룻밤 배양에서 살모넬라균의 농도를 결정합니다. 이렇게 하면 OD600이 분광사진계의 선형 범위에서 측정됩니다.
밀리리터당 살모넬라균 농도를 계산합니다. 하나의 OD600은 10억 개의 박테리아에 해당합니다. 대식세포 배지에서 박테리아를 희석하여 밀리리터당 125만 세포의 살모넬라 농도에 도달합니다.
세포를 살모넬라균으로 감염시키려면 BMDM에서 배지를 제거한다. 감염되지 않은 대조군 웰 B1 내지 B3 및 C1 내지 C3에 대식세포 배지 1밀리리터를 첨가한 다음, 웰 A1 내지
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