전처리된 인간 혈소판의 콜라겐 유도 응집을 모니터링하기 위한 탁도 분석

활성화

되지 않은 혈소판과 피브리노겐(혈장 당단백질)을 함유한 전처리된 인간 혈소판 현탁액이 들어 있는 유리 큐벳으로 시작합니다.

큐벳에는 균일한 혼합을 위한 교반 장치가 포함되어 있습니다.

탁도를 평가하여 응집을 측정하는 응집계에 제어 큐벳을 넣습니다.

혈

소판 응집을 위한 작용제인 콜라겐을 도입하여 혈소판의 표면 수용체와 상호 작용하고 다운스트림 신호 전달 캐스케이드를 활성화합니다.

이로 인해 혈소판 표면 채널인 Pannexin 1 채널을 통해 ATP가 방출되어 혈소판 활성화 및 모양 변화를 시작하여 응집 곡선이 함몰됩니다.

피브리노겐은 활성화된 혈소판을 추가로 가교하여 콜라겐 유도 혈소판 응집을 촉진하고 탁도를 변경하며 응집 곡선을 점진적으로 상승시킵니다.

이 채널을 차단하는 고농도의 Pannexin 1 채널 억제제로 테스트 큐벳을 처리합니다.

큐벳에 콜라겐을 첨가하십시오. 억제제 상호 작용은 ATP 방출을 방지하고 콜라겐 유도 혈소판 응집을 방해하며, 이는 변하지 않은 탁도와 평평한 응집 곡선에서 분명합니다.

혈

소판이 풍부한 혈장을 제조하려면 수집된 혈액의 5밀리리터 분취량을 15밀리리터 튜브로 옮기고 샘플을 250배g, 섭씨 37도에서 13분 동안 원심분리합니다. 원심분리할 때 적혈구와 백혈구 오염을 피하면서 샘플의 최상층을 흡인합니다. 그런 다음 얻은 혈소판이 풍부한 혈장을 새로운 15밀리리터 튜브로 옮기고 섭씨 37도에서 10분 동안 배양합니다. 혈소판 풍부 혈장을 2,200배 g에서 12분 동안 원심분리합니다.

다음으로, 상청액을 제거하고 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 Tris-HCl 완충액에 헤파린 밀리리터당 2마이크로리터와 25마이크로몰 프로스타사이클린의 밀리리터당 2.5마이크로리터를 포함하는 TA 완충액 10밀리리터에 펠릿을 조심스럽게 재현탁합니다. 샘플을 섭씨 37도에서 10분 동안 배양합니다. 그런 다음 25마이크로몰 프로스타사이클린을 밀리리터당 2.5마이크로리터씩 첨가하고 시료를 1,900배g으로 8분 동안 원심분리합니다.

회전 후 상청액을 제거하고 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 25마이크로몰 프로스타사이클린 밀리리터당 2.5마이크로리터를 포함하는 TA 완충액 5밀리리터에 펠릿을 재현탁합니다. 혈소판을 섭씨 37도에서 10분 동안 한 번 더 배양합니다. 샘플이 배양되는 동안 150마이크로리터의 혈소판 현탁액을 1.5밀리리터 튜브에 옮기고 자동 세포 계수기를 사용하여 혈소판 수를 계산