CXCR4 상호 작용 제제의 식별을 위한 세포 분석

CXCR4를 발현하는 부착된 인간 뇌암 세포가 들어 있는 젤라틴 코팅 멀티웰 플레이트를 가져 와서 보십시오.

배지를 칼슘에 민감한 염료로 교체하십시오. 세포내 에스테라아제는 염료를 칼슘 이온에 결합하는 막 불투과성 생성물로 절단하여 형광 증가를 나타냅니다.

염료를 제거하고 세척한 후 완충액을 첨가합니다.

CXCR4 상호 작용 화합물 및 케모카인 CXCL12 함유 플레이트가 있는 형광 마이크로플레이트 리더에 플레이트를 놓습니다.

설정된 자동 매개변수를 사용하여 증가하는 화합물 농도를 테스트 웰에 주입한 다음 특정 CXCL12 농도를 주입합니다.

화합물이 없는 대조군 웰에서 CXCL12는 CXCR4에 결합합니다.

이 결합은 신호 캐스케이드를 활성화하여 칼슘 이온을 세포질로 방출하고 그곳에서 염료와 결합하여 형광을 강화합니다.

그러나 테스트 웰에서 상호 작용하는 화합물은 CXCR4에 대한 CXCL12 결합을 억제하여 칼슘 동원에 영향을 미치고 용량 의존적 형광 감소를 유발하여 CXCR4 길항제임을 확인합니다.

세포 계대 당일, 바닥이 투명한 검은색 벽 폴리스티렌 96웰 플레이트의 각 웰을 100마이크로리터의 0.1% 젤라틴 용액으로 코팅하고 플레이트를 실온에서 2시간 동안 배양합니다. 젤라틴이 응고되는 동안 트립신-EDTA 용액을 사용하여 배양 플라스크 바닥에서 관심 세포를 들어 올리고 세포가 분리되면 50밀리리터 원뿔형 튜브의 신선한 성장 배지에 세포를 재현탁합니다.

계수 후, 원심분리에 의해 세포를 수집하고 펠릿을 신선한 성장 배지에 밀리리터당 1 x 10⁵ 생존 세포 농도로 재현탁합니다. 플레이트가 준비되면 여분의 젤라틴 용액을 버리고 실험실 티슈에서 플레이트를 건조시킵니다. 그런 다음 200마이크로리터의 PBS로 웰을 세척하고 웰당 200마이크로리터의 세포로 세척을 교체하여 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소에서 하룻밤 배양합니다.

다음날 아침, 접시를 두드려 우물에서 성장 배지를 버리고 종이 타월에 접시를 거꾸로 말립니다. 그런 다음 웰당 100마이크로리터의 로딩 염료 용액으로 각 웰의 세포를 라벨링하고 실온에서 어두운 곳에서 45분 동안 플레이트를 배양합니다. 세포가 배양되는 동안 웰당 75마이크로리터의 CXCL12를 케모카인 플레이트에 추가하고, 50마이크로리터의 관심 화합물을 화합물 플레이트의 각 웰에 첨가합니다.

그런 다음 형광 플레이트 리더의 쿨러 장치를 켠 다음 플레이트 리더 자체를 켭니다. 시스템이