CXCR4 상호 작용 제제의 식별을 위한 세포 분석

CXCR4를 발현하는 부착된 인간 뇌암 세포가 들어 있는 젤라틴 코팅 멀티웰 플레이트를 가져 와서 보십시오.

배지를 칼슘에 민감한 염료로 교체하십시오. 세포내 에스테라아제는 염료를 칼슘 이온에 결합하는 막 불투과성 생성물로 절단하여 형광 증가를 나타냅니다.

염료를 제거하고 세척한 후 완충액을 첨가합니다.

CXCR4 상호 작용 화합물 및 케모카인 CXCL12 함유 플레이트가 있는 형광 마이크로플레이트 리더에 플레이트를 놓습니다.

설정된 자동 매개변수를 사용하여 증가하는 화합물 농도를 테스트 웰에 주입한 다음 특정 CXCL12 농도를 주입합니다.

화합물이 없는 대조군 웰에서 CXCL12는 CXCR4에 결합합니다.

이 결합은 신호 캐스케이드를 활성화하여 칼슘 이온을 세포질로 방출하고 그곳에서 염료와 결합하여 형광을 강화합니다.

그러나 테스트 웰에서 상호 작용하는 화합물은 CXCR4에 대한 CXCL12 결합을 억제하여 칼슘 동원에 영향을 미치고 용량 의존적 형광 감소를 유발하여 CXCR4 길항제임을 확인합니다.

세포 계대 당일, 바닥이 투명한 검은색 벽 폴리스티렌 96웰 플레이트의 각 웰을 100마이크로리터의 0.1% 젤라틴 용액으로 코팅하고 플레이트를 실온에서 2시간 동안 배양합니다. 젤라틴이 응고되는 동안 트립신-EDTA 용액을 사용하여 배양 플라스크 바닥에서 관심 세포를 들어 올리고 세포가 분리되면 50밀리리터 원뿔형 튜브의 신선한 성장 배지에 세포를 재현탁합니다.

계수 후, 원심분리에 의해 세포를 수집하고 펠릿을 신선한 성장 배지에 밀리리터당 1 x 10⁵ 생존 세포 농도로 재현탁합니다. 플레이트가 준비되면 여분의 젤라틴 용액을 버리고 실험실 티슈에서 플레이트를 건조시킵니다. 그런 다음 200마이크로리터의 PBS로 웰을 세척하고 웰당 200마이크로리터의 세포로 세척을 교체하여 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소에서 하룻밤 배양합니다.

다음날 아침, 접시를 두드려 우물에서 성장 배지를 버리고 종이 타월에 접시를 거꾸로 말립니다. 그런 다음 웰당 100마이크로리터의 로딩 염료 용액으로 각 웰의 세포를 라벨링하고 실온에서 어두운 곳에서 45분 동안 플레이트를 배양합니다. 세포가 배양되는 동안 웰당 75마이크로리터의 CXCL12를 케모카인 플레이트에 추가하고, 50마이크로리터의 관심 화합물을 화합물 플레이트의 각 웰에 첨가합니다.

그런 다음 형광 플레이트 리더의 쿨러 장치를 켠 다음 플레이트 리더 자체를 켭니다. 시스템이 시작될 때까지 몇 분 동안 기다린 후 플레이트 리더 소프트웨어를 엽니다. 분석 프로토콜을 설정하려면 설정 탭에서 읽기 모드를 선택하고 로딩 염료에 적합한 여기 및 방출 파장을 선택합니다.

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이송 유체 와 혼합" 탭을 선택하여 컴파운드 플레이트에서 화합물을 자동으로 혼합합니다. "이송 유체" 탭에서 측정 플레이트로 이송할 복합 플레이트에서 각 웰의 20마이크로리터를 설정하고 피펫 팁을 액체 표면 아래 20마이크로리터에 배치합니다. 흡인 속도를 초당 50마이크로리터로, 분배 속도를 초당 25마이크로리터로 설정하고 "전사 유체로 읽기"를 클릭합니다.

첫 번째 간격 동안 1초의 판독 간격 시간으로 60개의 판독을 선택하고 화합물이 측정 플레이트에 분배되기 전에 10개의 판독을 기록하고 그 후에 50개의 판독을 완료합니다. 읽기 간격 시간을 30초로 설정하고 읽기를 18회에 넣어 두 번째 간격을 설정합니다. 프로토콜에 대해 세 번의 팁 세척을 선택하고 적절한 세척액, 1회 세척 주기, 빠른 펌프 속도 및 세척당 5번의 스트로크를 포함하도록 각 세척 단계를 설정합니다.

"피펫터 일시 중지" 기능을 사용하여 300초의 피펫터 일시 중지를 포함하고 "이송 유체와 혼합" 설정을 사용하여 케모카인 플레이트 내에서 CXCL12 용액을 자동으로 혼합할 수 있습니다. 후속 "Transfer Fluid" 탭에서 측정 플레이트로 이송할 케모카인 플레이트의 각 웰에서 25마이크로리터를 설정하고 팁을 액체 표면 아래에 20마이크로리터 아래에 배치합니다. 흡인 속도를 초당 50마이크로리터로 설정하고 분배 속도를 초당 25마이크로리터로 설정합니다.

"이송 유체로 읽기" 버튼을 사용하여 1초의 판독 간격 시간으로 145개의 판독을 포함하도록 첫 번째 간격을 설정합니다. 두 번째 간격을 6초의 읽기 간격 시간과 20개의 읽기로 설정합니다. 세 개의 세탁 팁 주기를 더 선택한 다음 "설정 Stage 온도"를 클릭하고 장치 온도를 섭씨 37도로 설정합니다.

로딩 염료 배양이 끝나면 측정 플레이트에서 완충액을 버리고 실험실 티슈에서 플레이트를 건조시킵니다. 분석 완충액의 웰당 150마이크로리터로 세포를 세척하고, 2분 후에 완충액을 80마이크로리터의 분석 완충액으로 교체합니다. 측정 플레이트를 판독 위치에 놓고, 복합 플레이트를 소스 2 위치에, 케모카인 플레이트를 소스 3 위치에 놓고, 소스 1 위치에 검은색 팁 상자를 놓습니다.

장치를 닫고 "프로토콜 신호 테스트"를 클릭하여 플레이트 위의 배경 상대 조명 단위와 형광 변형을 결정합니다. 팝업 창에서 "신호 테스트"를 선택합니다. 8,000에서 10,000 상대 조명 단위의 배경 값을 얻으면 "업데이트"를 선택하고 "저장"을 클릭하여 기본 프로토콜을 저장합니다.