α-갈락토시다아제 A 및 산 α-글루코시다아제 효소 활성의 체외 측정

α-갈락토시다제 A와 산성 α-글루코시다아제는 세포 대사에 중요한 리소좀 효소입니다.

α-갈락토시다제 A는 당지질과 같은 기질을 분해하는 반면, 산성 α-글루코시다아제는 글리코겐을 가수분해합니다.

시험관 내에서 효소 활성을 측정하려면 각각 알려진 농도의 α-갈락토시다제 A 및 산성 α-글루코시다아제를 포함하는 샘플로 멀티웰 플레이트 웰을 채취하십시오.

필요한 양의 합성 4-메틸 움벨리페릴 기질의 산성 용액을 웰에 추가하고, 이러한 효소에 대한 천연 기질을 모방하도록 설계된 특정 형광 기질입니다.

어둠 속에서 배양하십시오.

α-갈락토시다제 A와 산성 α-글루코시다제 효소는 각각의 기질을 절단하여 형광 생성물인 4-메틸룸벨리페론을 방출합니다.

효소 반응을 종료하기 위해 알칼리성 완충액을 추가합니다.

마이크로플레이트 형광 판독기를 사용하여 농도를 나타내는 웰에서 4-메틸룸벨리페론의 형광 강도를 측정하여 각각 α-갈락토시다제 A 및 산성 α-글루코시다제 효소 활성을 결정합니다.

각 샘플의 계산된 양을 희석하고 신선한 1.5밀리리터 반응 튜브에 피펫팅하여 용액 마이크로리터당 0.05마이크로그램의 알파-갈락토시다제 A 또는 0.5마이크로그램의 산성 알파-글루코시다아제를 얻습니다. 샘플을 다시 5초 동안 소용돌이치고 이 희석액의 10마이크로리터를 피펫팅하고 96웰 플레이트에 복제합니다.

각 기질 용액 20마이크로리터를 첨가하여 반응을 시작합니다. 알파-갈락토시다제 A의 경우, 0.06몰 인산염 구연산염 완충액, pH 4.7에 2밀리몰 4-메틸윤벨리페릴-알파-D-갈락토피라노사이드 또는 4-MU-Gal을 첨가합니다. 산성 알파-글루코시다아제의 경우 0.025몰 아세테이트나트륨, pH 4.0에 2밀리몰 4-메틸윤벨리페릴-알파-D-글루코피라노사이드 또는 4-MU-글루를 첨가합니다.

효

소 반응을 옥도 쉐이커에서 섭씨 37도 및 300RPM의 어두운 곳에서 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 200마이크로리터의 1.0몰 pH 10.5 조정된 글리신 수산화나트륨 완충액을 첨가하여 반응을 종료합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 밀리리터당 0.01밀리그램의 스톡에서 4MU의 표준 곡선을 준비하고 10마이크로리터의 용액을 이중으로 96웰 플레이트에 피펫팅합니다.

부피와 pH를 조정하기 위해 각 웰에 200마이크로리터의 1.0몰 글리신 수산화나트륨 완충액을 추가합니다. 마지막으로, 적절한 필터 세트가 장착된 형광 리더에서 효소 활성을 측정하고 형