항바이러스 화합물 스크리닝을 위한 바이러스 부착 분석

사전 냉각된 인간 간암 세포 단층이 포함된 멀티웰 플레이트로 시작합니다.

루시페라아제 유전자를 운반하는 유전자 변형 C형 간염 바이러스와 표적 화합물의 혼합물로 테스트 웰을 처리하고, 바이러스 단독으로 대조군 웰을 처리한다.

테스트 웰에서 표적 분자는 바이러스 당단백질 및 세포 표면 수용체와 상호 작용하여 바이러스 부착을 방지합니다.

그러나 대조군 우물에서는 바이러스 당단백질이 세포 표면 수용체와 상호 작용하여 부착을 가능하게 합니다. 낮은 온도는 바이러스 침입을 억제합니다.

상청액을 제거하고 배지를 도입한 다음 최적의 온도에서 다시 배양하여 바이러스 침입을 촉진합니다.

바이러스가 진입하면 유전 물질을 방출하여 배지로 분비되는 바이러스 단백질과 루시페라아제 효소의 합성을 시작합니다.

루시페라아제 함유 상청액을 옮기고 기질을 도입합니다.

효소-기질 상호작용은 루시페라아제 수준에 비례하여 빛을 생성합니다.

대조군 웰에 비해 테스트 웰의 낮은 광도는 표적 화합물의 항바이러스 특성을 나타냅니다.

바이러스 부착 분석의 경우, 96웰 플레이트에 웰당 1 x 10⁴ 세포를 플레이트하고 세포 부착을 위해 밤새 배양합니다. 다음날 아침, 먼저 세포 단층이 포함된 96웰 플레이트를 섭씨 4도에서 1시간 동안 식힙니다.

얼음 위에 테스트 화합물과 바이러스 혼합물을 준비합니다. 예를 들어, HCV-CHLA, HCV - 1% DMSO 또는 각 처리 웰에 대해 10² FFU 바이러스가 포함된 양성 대조군 HCV-헤파린 용액. 세포 배양 웰에서 배지를 부드럽게 흡인합니다. 그런 다음 즉시 100마이크로리터의 바이러스 테스트 화합물 혼합물을 세 번 우물에 넣고 온도가 올라가지 않도록 주의합니다. 플레이트를 섭씨 4도에서 유지된 냉장고에서 3시간 동안 배양합니다.

바이러스 입자는 섭씨 4도에서 세포 표면에 부착되지만 내재화되지는 않습니다. 다음으로 상청액을 흡인합니다. 200마이크로리터의 얼음처럼 차가운 PBS로 세포를 부드럽게 두 번 세척합니다. 각 웰에 100마이크로리터의 기초 배지를 첨가한 다음 섭씨 37도에서 72시간 동안 배양합니다. 마지막으로, 감염된 세포에서 방출된 루시페라아제 리포터를 정량화하기 위해 각 샘플 웰에서 상청액을 수집하고 Gaussia 루시페라아제 분석을 수행합니다.