0 조회수 • 2:38 분 • July 8th, 2025
간암 세포를 채취하여 엔도사이토시스를 손상시키기 위해 저온에서 배양합니다.
분비된 루시페라아제 리포터를 암호화하는 조작된 RNA 게놈을 포함하는 재조합 C형 간염 바이러스 또는 HCV를 도입합니다.
바이러스 지단백질은 숙주 세포의 프로테오글리칸과 상호 작용하는 반면, 바이러스 외피 당단백질은 특정 숙주 수용체에 결합합니다.
선택된 웰에 바이러스 당단백질에 결합하는 시험 화합물을 첨가합니다.
생리학적 온도에서 배양하면 결합된 바이러스는 엔도사이토시스됩니다.
내재화되지 않은 바이러스를 버리고 성장 배지를 추가하고 배양합니다.
처리되지 않은 웰에서 당단백질은 바이러스 외피-엔도좀 융합을 돕고 뉴클레오캡시드를 방출하는 반면, 화합물 마스킹은 처리된 웰의 융합을 손상시킵니다.
방출 시 RNA는 세포외에서 분비되는 루시페라아제를 포함한 바이러스 단백질을 발현합니다.
루시페라아제 함유 상청액을 수확하고 루시페라아제에 의해 산화되어 빛을 방출하는 생물발광 기질을 첨가합니다.
처리되지 않은 웰에 비해 처리된 웰의 발광 감소는 바이러스 외피-엔도좀 융합의 억제를 나타냅니다.
바이러스 융합 및 진입을 분석하기 위해, 세포 부착을 위해 하룻밤 배양한 후 1시간 동안 세포 배양 플레이트를 섭씨 4도에서 미리 식힙니다. 웰에서 기존 배지를 제거하고 얼음 위에 10 내지 두 번째 FFU HCV로 세포를 감염시킵니다.
플레이트를 섭씨 4도에서 3시간 동안 배양합니다. 200마이크로리터의 얼음처럼 차가운 PBS로 세포를 부드럽게 두 번 세척하여 부착되지 않은 바이러스를 제거합니다. 그런 다음 얼음 위에서 기저 배지 또는 1% DMSO를 대조군으로 하는 기저 배지에 용해된 시험 화합물로 세포를 처리하고 플레이트를 섭씨 37도에서 3시간 동안 배양합니다. 이를 통해 섭씨 37도에서 발생하는 바이러스 침입에 대한 테스트 화합물을 평가할 수 있습니다.
배지를 흡인하고 내재화되지 않은 바이러스를 200마이크로리터의 구연산염 완충액 또는 PBS로 두 번 세척합니다. 웰당 100마이크로리터의 기초 배지를 추가하고 섭씨 37도에서 72시간 더 배양합니다. 상청액을 수집하고 방출된 루시페라아제 리포터를 검출하기 위해 이전에 시연된 대로 Gaussia 루시페라아제 분석을 수행합니다.