변형된 리트머스 테스트를 사용한 박테리아 바이오마커의 비색 검출

특정 박테리아 바이오마커에 결합하면 활성화되는 촉매 DNA인 RNA 절단 DNA자임으로 시작합니다.

DNAzyme은 5' 말단의 비오틴을 통해 스트렙타비딘으로 코팅된 마그네틱 비드에 연결됩니다. 3' 말단에서 올리고뉴클레오티드 결합 우레아제에 결합되어 기능성 자기 비드를 형성합니다.

기능성 마그네틱 비드가 들어 있는 튜브에 대장균 용해물을 첨가합니다.

용해물의 특정 대장균 바이오마커는 DNA효소를 활성화하여 RNA 결합의 절단을 유발하여 DNA효소-우레아제 접합체의 분리를 유발합니다.

마그네틱 스탠드를 사용하여 비드를 고정하고 비드에 결합된 DNA효소-우레아제 접합체를 제거합니다.

방출된 우레아제 함유 상청액을 다른 튜브로 옮깁니다.

pH 지시 염료(페놀 레드)와 요소 용액을 추가합니다.

우레아제는 요소를 암모니아와 이산화탄소로 가수분해합니다.

약한 염기인 암모니아는 용액의 pH를 높여 색상 변화를 일으켜 대장균 바이오마커의 존재를 나타냅니다.

텍스트 프로토콜에 따라 대장균 세포를 준비한 후, 100마이크로리터의 RB를 추가하고 와돌이시켜 1.5밀리리터 미세분리기 튜브를 미리 세척합니다. 그런 다음 버퍼를 버립니다.

세척

된 튜브에 조립된 EC1 15마이크로리터를 추가한 다음 튜브를 마그네틱 랙에 놓고 상청액을 흡인합니다. 랙에서 튜브를 제거하고 100마이크로리터의 RB를 추가한 다음 마그네틱 비드를 조심스럽게 재현탁합니다.

RB를 사용하여 비드를 두 번 더 세척하고 RB를 제거한 후 10마이크로리터의 대장균 샘플을 튜브에 넣고 튜브를 두드려 내용물을 부드럽게 혼합합니다. 그런 다음 반응을 실온에서 1시간 동안 배양합니다.

배양 후 90마이크로리터의 이중 증류수를 넣고 튜브를 마그네틱 랙에 놓습니다. 약 3분 동안 자기 분리 후 85마이크로리터의 상층액을 0.5밀리리터 미세분리기 튜브로 조심스럽게 옮깁니다.

자기 비드를 차지하지 않고 용액을 조심스럽게 피펫팅하는 것이 매우 중요합니다. 이 비드에는 우레아제가 함유되어 있으며 위양성 신호를 생성합니다.

0.04% 페놀 레드 15마이크로리터와 기질 용액 100마이크로리터를 첨가합니다. 그런 다음 특정 시간 간격으로 사진을 찍어 색상 변화를 기록합니다.