폭스바이러스 감염 세포의 번역 조절을 연구하기 위한 Luciferase Reporter 분석

반딧불이 루시페라아제 또는 Fluc 및 레닐라 루시페라아제 또는 Rluc를 암호화하는 리포터 mRNA를 포함하는 형질감염 복합체를 가져 가십시오.

Fluc mRNA에는 5' 폴리아데노신 서열 또는 폴리(A) 리더가 포함되어 있지만 Rluc mRNA에는 이 서열이 없습니다.

감염되지 않은 포유류 세포와 폭스바이러스에 감염된 포유류 세포를 형질감염시켜 리포터 mRNA를 전달하고 배양합니다.

감염되지 않은 세포에서 진핵생물 개시 인자는 mRNA의 5' 캡에 결합한 후 작은 리보솜 서브유닛과 개시제 tRNA가 모집됩니다.

작은 서브유닛이 시작 코돈을 찾으면 큰 서브유닛이 결합하여 루시페라아제 단백질을 합

성합니다.

감염된 세포에서 작은 서브유닛의 폭스바이러스 매개 인산화는 리더 서열에서 직접 리보솜 조립을 일으켜 플럭스 생산을 향상시킵니다.

세포를 용해하여 루시페라아제를 방출합니다.

효소가 산화시켜 빛을 방출하는 Fluc 기질을 추가합니다. 플레이트 리더를 사용하여 발광을 측정합니다.

Rluc에 대해 단계를 반복하여 바이러스 감염 세포에서 Rluc와 비교하여 Fluc 발광의 상대적 증가를 결정합니다.

HeLa 세포를 24웰 플레이트에 시딩하여 다음날 80%에서 90%의 컨플루언티를 달성하고 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소와 함께 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양합니다. HeLa 세포를 5의 감염 다중도에서 백시니아 바이러스로 감염시키고 비교를 위해 감염되지 않은 HeLa 세포를 보관한 다음 플레이트를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소와 함께 10-12시간 동안 배양합니다. 감염 후 원하는 시간 후, 480나노그램의 12A 서열 함유 반딧불이 루시페라제 mRNA와 20나노그램의 Kozak 서열 함유 레닐라 루시페라아제 mRNA를 하나의 미세 원심분리기 튜브에 혼합합니다.

다른 미세 원심분리기 튜브에 1.1마이크로리터의 양이온성 지질 형질감염 시약을 추가합니다. 55마이크로리터의 환원 혈청 배지를 양쪽 튜브에 추가합니다. 혼합하고 실온에서 5분 동안 배양합니다. 그런 다음 환원 혈청 배지를 함유한 55마이크로리터 양이온성 지질 형질감염 시약을 mRNA 함유 튜브에 첨가합니다. 피펫으로 부드럽지만 철저하게 섞고 실온에서 15분 동안 배양합니다. 배양하는 동안 세포에서 세포 배양 배지를 제거하고 웰당 400마이크로리터의 환원 혈청 배지를 추가합니다.

배양이 완료되면 24웰 플레이트의 웰당 100마이크로리터의 혼합물을 적가하여 균일