항생제의 최소 억제 농도를 평가하기 위한 마이크로타이터 플레이트 방법

연속적으로 희석된 아미노글리코사이드 항생제가 들어 있는 마이크로타이터 플레이트를 섭취하십시오. 접시 중 하나에는 합성 약물인 NTBC가 들어 있습니다.

그람 음성 박테리아인 녹농균을 도입하고 배양합니다.

박테리아는 NTBC로 처리되지 않은 우물에서 세포외 보호용 색소인 파이오멜라닌을 생성하는 반면, 약물은 파이오멜라닌 생성을 방지합니다.

양이온성 항생제는 박테리아 외막의 음이온성 지질다당류(LPS)에 결합하여 양이온성 가교를 대체하고 막을 불안정하게 만듭니다.

박테리아에 들어가면 항생제는 30S 리보솜 서브유닛의 아미노아실 부위 또는 A 부위에 결합합니다.

결합된 항생제는 mRNA를 가로지르는 아미노아실-tRNA 결합 및 리보솜 이동을 방지하여 단백질 합성을 방해하고 박테리아 성장을 억제합니다.

배양 후 배양의 광학 밀도를 측정하여 박테리아 성장을 평가합니다.

박테리아 성장을 방지하는 가장 낮은 항생제 농도는 최소 억제 농도 또는 MIC입니다.

NTBC 처리 및 NTBC 미처리 우물에 대한 유사한 MIC 값은 박테리아의 항생제 감수성에 NTBC의 영향이 없음을 나타냅니다.

MIC 분석 하루 전, 2-[2-니트로-4-트리플루오로메틸)벤조일]-1-3 사이클로헥산디온 또는 NTBC를 유무에 관계없이 LB에서 테스트할 균주의 배양물을 준비합니다. 이 시연은 NTBC의 대표적인 수준인 300마이크로몰을 사용합니다. NTBC의 적절한 농도를 결정하기 위한 적정 방법은 프로토콜 텍스트에 설명되어 있습니다. 폭기와 함께 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다. 다음날 MIC 분석을 위한 LB plus NTBC 및 LB plus DMSO 마스터 용액을 만듭니다.

한 균주에 대해 하나의 항생제를 테스트하려면 600마이크로몰의 NTBC를 2밀리리터의 LB에 넣고 혼합하여 NTBC 마스터 용액을 만듭니다. NTBC는 접종물을 첨가할 때 2배로 희석되어 최종 농도가 300마이크로몰이 되기 때문에 600마이크로몰의 농도로 첨가됩니다. 동등한 부피의 차량 DMSO를 2밀리리터 LB에 추가하고 혼합하여 NTBC가 없는 마스터 용액을 만듭니다. 이 두 가지 마스터 솔루션은 항생제 스톡 용액을 생성하고 96웰 플레이트에서 희석 시리즈를 설정하는 데 사용됩니다.

다음으로, LB 플러스 NTBC 또는 LB 플러스 DMSO 마스터 용액에서 항생제 용액을 준비합니다. 겐타마이신 플러스 또는 마이너스 NTBC 원액을 밀리리터당 64마이크로그램으로 준비합니다. 카나마이신 플러스 또는 마이너스 NTBC 원액을 밀리리터당 256마이크로그램으로 만듭니다. 토브라마이신 플러스 또는 마이너스 NTBC 원액을 밀리리터당 8마이크로그램으로 준비합니다.

2X 항생제 용액을 만든 후, 각 항생제 용액 100마이크로리터를 행 A의 96웰 플레이트에 있는 4개의 웰에 추가합니다. 예를 들어, 겐타마이신은 A1에서 A4까지 넣어야 합니다. 카나마이신은 A5에서 A8까지, 토브라마이신은 A9에서 A12까지에 배치해야 합니다.

LB 플러스 NTBC 또는 LB 플러스 DMSO 마스터 용액 50마이크로리터를 96웰 플레이트의 행 B에서 H까지 추가합니다. 한 플레이트가 LB와 NTBC이고 한 플레이트가 LB와 DMSO인지 확인하십시오. 마이크로피펫 헤더를 사용하여 50마이크로리터의 용액을 행 A에서 행 B로 옮겨 항생제를 2배 연속 희석합니다. 용액을 혼합하고 피펫 팁을 교체한 다음 50마이크로리터의 용액을 행 B에서 행 C로 옮깁니다. 나머지 행에 대해 반복합니다.

G 행을 희석한 후 해당 행에서 50마이크로리터의 용액을 제거하고 폐기합니다. 박테리아 성장을 위한 무항생제 대조군으로 행 H를 사용하십시오. 하룻밤 동안 배양을 검색합니다. 배지에 존재하는 바이오멜라닌을 제거하기 위해 모든 배양물을 세척한 후 배양액의 OD₆₀₀을 측정합니다. LB에서 하룻밤 배양균을 희석합니다.

다중 채널 마이크로피펫을 사용하여 희석된 박테리아 배양액 50마이크로리터를 적절한 웰에 추가합니다. 각 균주 및 항생제 농도에 대해 3개의 웰에 박테리아를 추가합니다. 박테리아 오염을 제어하는 역할을 하기 위해 네 번째 웰에 50마이크로리터의 LB를 추가합니다. 96웰 플레이트를 파라필름으로 덮고 섭씨 37도에서 약 24시간 동안 배양합니다.

다음날 플레이트에서 우물의 박테리아 성장이 있는지 육안으로 검사하십시오. MIC는 각 균주의 세 번의 반복 모두에 대해 박테리아 성장이 보이지 않는 가장 낮은 농도의 항생제입니다.