0 조회수 • 4:10 분 • July 8th, 2025
생리학적 세포외 기질 또는 ECM을 모방한 콜라겐으로 겹쳐진 다양한 강성의 폴리아크릴아미드 하이드로겔이 포함된 웰을 가져 와서 섭취하십시오.
하이드로겔 강성을 감지하기 위해 초점 접착 또는 FA(세포-ECM 결합을 매개하는 복합체)를 형성하는 미세혈관 내피 세포를 추가합니다.
더 단단한 하이드로겔은 더 부드러운 하이드로겔에 비해 세포골격 성분인 비멘틴의 세포 표면 발현을 증가시킵니다.
액틴 조립 유도 단백질(ActA)의 프로모터 아래에서 형광 단백질을 발현하도록 조작된 Listeria monocytogenes 박테리아를 추가합니다.
박테리아와 숙주 세포의 접촉을 동기화하고 배양하기 위해 원심분리합니다.
박테리아는 비멘틴에 결합합니다. 더 단단한 하이드로겔 결합 숙주 세포에 더 많은 비멘틴은 더 많은 박테리아 부착과 엔도사이토시스로 이어집니다.
항생제를 추가하여 내재되지 않은 박테리아를 제거합니다.
내재화된 박테리아는 독소를 분비하여 엔도좀 막을 파열시킵니다. 세포질 탈출은 ActA 프로모터를 활성화하여 형광 단백질을 발현하고 세포내 박테리아를 표지합니다.
세포를 효소적으로 분리합니다. 유세포 분석을 사용하여 더 단단한 하이드로겔에 상주하는 숙주 세포에서 더 높은 형광을 검출하여 더 큰 박테리아 내재화를 나타냅니다.
텍스트 프로토콜에 따라 L. monocytogenes의 하룻밤 배양을 준비한 후, 배양액 1ml를 미세 원심분리기 튜브로 옮기고 2,000배 g 및 실온에서 4분 동안 회전시킵니다. 조직 배양 등급 PBS를 사용하여 펠릿을 두 번 세척한 후 PBS 1밀리리터를 사용하여 펠릿을 재현탁합니다.
숙주 세포당 약 50개의 박테리아 또는 숙주 세포당 10개의 박테리아의 감염 다중도 또는 MOI를 위해 10 또는 50마이크로리터의 박테리아 현탁액과 1밀리리터의 MCDB-131 전체 배지를 결합하여 감염 혼합물을 준비합니다. 하이드로겔이나 세포를 방해하지 않도록 주의하면서 24웰 플레이트의 웰에서 배지를 제거합니다. MCDB-131 전체 배지 1밀리리터를 사용하여 세포를 한 번 세척한 다음 각 웰에 박테리아 1밀리리터를 추가합니다.
접시에 뚜껑을 덮고 누출을 방지하기 위해 폴리에틸렌 식품 랩으로 싸십시오. 침입을 동기화하기 위해 플레이트를 2,000배g에서 10분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 배양액을 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다. MCDB-131 전체 배지를 사용하여 샘플을 4회 세척하고 조직 배양 인큐베이터로 되돌립니다. 추가 30분 후, 게이지를 겐타마이신 밀리리터당 20마이크로그램이 보충된 MCDB-131 전체 배지로 교체합니다.
감염 후 8시간 후에 유세포 분석을 수행하려면 24웰 플레이트의 웰에서 배지를 제거하고 조직 배양 PBS를 사용하여 웰을 한 번 세척합니다. PBS를 제거한 후 각 웰에 200마이크로리터의 트립신-EDTA-콜라게나제 혼합물을 추가합니다. 세포가 완전히 분리될 수 있도록 접시를 조직 배양 인큐베이터에 10분 동안 넣습니다.
각 웰을 8회 부드럽게 피펫팅한 후 200마이크로리터의 전체 배지를 첨가하여 트립신을 중화시킵니다. 각 웰에서 400마이크로리터의 세포 용액을 35마이크로미터 세포 스트레이너 캡이 있는 5밀리리터 폴리스티렌 튜브로 옮깁니다. 유세포 분석법으로 샘플을 분석합니다.