세포외 기질 강성에 따른 박테리아 전파를 평가하기 위한 정량적 타임랩스 현미경

다양한 강성의 콜라겐 코팅 폴리아크릴아미드 하이드로겔 위에 부착된 인간 내피 세포 단층이 있는 멀티웰 플레이트를 가져 와서 사용하십시오.

더 단단한 하이드로겔의 세포는 상당한 세포골격 재구성을 거쳐 부드러운 하이드로겔에 비해 세포내 긴장을 증가시킵니다.

배지로 세포를 세척하고 액틴 조립 유도 단백질(ActA) 프로모터 하에서 형광 단백질을 발현하는 조작된 Listeria monocytogenes를 추가합니다.

세포-박테리아 접촉을 용이하게 하는 원심분리기. 박테리아 엔도사이토시스를 매개하기 위해 배양합니다.

미디어로 씻으십시오. 내재되지 않은 박테리아를 제거하기 위해 겐타마이신으로 치료하십시오. 인큐베이트.

내면화된 박테리아는 기공 형성 독소를 방출하여 식세포막을 파괴합니다. 세포질 박테리아는 ActA 및 형광 단백질 발현을 상향 조절하여 세포내 박테리아를 표지합니다.

ActA 단백질은 액틴 중합을 유도하여 박테리아를 앞으로 추진하는 액틴 혜성 꼬리를 형성하고 인접 세포에 의한 내재화를 유발하고 전파를 촉진합니다.

배양 후 염료 함유 배지를 사용하여 세포 핵을 염색합니다. 게이지를 겐타마이신이 함유된 배지로 교체하십시오.

타임랩스 현미경 검사를 수행합니다.

더 부드러운 하이드로겔은 세포내 장력이 증가한 더 단단한 하이드로겔에 비해 빠른 박테리아 세포간 확산을 촉진하여 기질 강성 의존성 박테리아 전파를 시사합니다.

텍스트 프로토콜에 따라 L. monocytogenes의 하룻밤 배양을 준비한 후, 배양액 1ml를 미세 원심분리기 튜브로 옮기고 2,000배 g 및 실온에서 4분 동안 회전시킵니다. 조직 배양 등급 PBS를 사용하여 펠릿을 두 번 세척한 후 PBS 1밀리리터를 사용하여 펠릿을 재현탁합니다.

숙주 세포당 약 50개의 박테리아 또는 숙주 세포당 10개의 박테리아의 감염 다중도 또는 MOI를 위해 10 또는 50마이크로리터의 박테리아 현탁액과 1밀리리터의 MCDB-131 전체 배지를 결합하여 감염 혼합물을 준비합니다. 하이드로겔이나 세포를 방해하지 않도록 주의하면서 24웰 플레이트의 웰에서 배지를 제거합니다.

MCDB-131 전체 배지 1밀리리터를 사용하여 세포를 한 번 세척한 다음 각 웰에 박테리아 1밀리리터를 추가합니다. 접시에 뚜껑을 덮고 누출을 방지하기 위해 폴리에틸렌 식품 랩으로 싸십시오. 플레이트를 2,000 x g에서 10분 동안 원심분리하여 침입을 동기화합니다. 그런 다음 배양액을 섭씨 37도