0 조회수 • 2:48 분 • July 8th, 2025
항바이러스제로 처리된 감염된 돼지 각막에서 얻은 바이러스 함유 샘플로 시작합니다.
샘플을 연속적으로 희석하여 감소하는 바이러스 농도의 시퀀스를 생성합니다.
최적의 희석은 여러 바이러스에 의한 단일 세포 감염을 방지합니다.
희석된 샘플을 숙주 세포 단층에 도입하고 배양합니다.
바이러스는 숙주 세포 수용체에 부착되어 세포에 들어가 복제를 시작합니다. 감염된 세포가 용해되어 비리온을 방출합니다.
바이러스를 주변 세포에 가두는 점성 물질인 메틸셀룰로오스를 첨가합니다.
그 후, 바이러스는 감염된 부위에 세포 사멸과 플라크 형성을 일으킵니다.
메탄올을 첨가하여 세포를 고정합니다.
크리스탈 바이올렛을 사용하여 살아있는 세포를 염색합니다.
플라크를 감염된 세포와 세포 사멸을 나타내는 명확한 영역으로 관찰하고, 크리스탈 바이올렛으로 염색된 감염되지 않은 세포로
둘러싸여 있습니다.마지막으로, 항바이러스제의 효능을 결정하기 위해 시작 용액의 바이러스 역가를 정량화하기 위해 가장 높은 희석액에서 플라크의 수를 계산합니다.
각 각막에서 수집된 바이러스의 양을 정량화하기 위해, 1 x 10-8의 희석에 도달할 때까지 미세 원심분리기 튜브의 무혈청 배지에서 바이러스의 로그10 1배 희석액을 준비합니다.
세포의 각 웰에서 성장 배지를 흡인한 후, 1 x 10-3에서 시작하여 각 바이러스 희석액 1밀리리터를 도금된 세포 단층으로 옮기고 감염된 세포를 세포 배양 인큐베이터에 2시간 동안 넣습니다. 배양이 끝나면 각 웰을 PBS로 2회 부드럽게 세척한 후 72시간 배양 동안 또는 플라크 형성이 관찰될 때까지 각 웰에 메틸셀룰로오스가 함유된 배지 2밀리리터를 추가합니다.
플라크 관찰 시 각 웰의 모서리에 1밀리리터의 메탄올을 천천히 첨가하여 실온에서 15분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 세포 단층을 방해하지 않고 각 웰에서 내용물을 천천히 흡인합니다.
다음으로, 1밀리리터의 크리스탈 바이올렛 작업 용액으로 각 웰을 라벨링하고 모든 세포가 빛으로부터 보호된 30분 동안 배양되도록 주의합니다. 배양이 끝나면 용액을 버리고 흡수성 종이 한 장에 우물을 말리십시오. 그런 다음 가장 높은 희석 웰에서 플라크의 수를 세어 시작 용액의 총 바이러스 함량을 3회 정량화합니다.