바이러스에 감염된 세포에서 다미생물 생물막 개시를 결정하기 위한 분석

포유류 세포 단층이 포함된 멀티웰 플레이트를 가져 가십시오.

단순 포진 바이러스가 있는 종자 테스트 우물. 통제 우물에는 바이러스가 없습니다.

바이러스는 세포 표면 헤파란 황산염에 부착하고 엔도사이토시스를 통해 내재화됩니다.

바이러스 감염은 헤파라나제 분비를 유발하여 헤파란 황산염을 절단하고 특정 진균 수용체를 제거합니다.

세포를 황색포도상구균 및 칸디다 알비칸스 배아관과 함께 배양합니다.

바이러스에 감염된 세포에서 헤파란 황산염 고갈은 박테리아 상호작용을 억제하는 동시에 진균 수용체 상호작용을 촉진하여 박테리아-진균 공동 국소화를 방지합니다.

대조군 세포에서 박테리아는 헤파란 황산염과 상호 작용하는 반면 곰팡이는 사용 가능한 수용체에 결합합니다.

이러한 미생물 공동 국소화는 생물막 형성의 첫 번째 단계인 접착력을 시작합니다.

배양 후 결합되지 않은 미생물을 제거합니다. 용해 완충액으로 오버레이하여 박테리아와 곰팡이를 배지로 방출합니다.

성장 배지가 들어 있는 플레이트에 세포 용해물을 퍼뜨립니다. 식민지 형성을 위해 배양합니다.

박테리아 콜로니의 감소와 그에 상응하는 진균 콜로니의 증가는 박테리아-진균 공동 국소화 및 생물막 개시의 바이러스 유도 억제를 나타냅니다.

다미생물 생물막 분석을 수행하려면 밀리리터당 5번째 HeLa 세포에 200 마이크로리터의 2 곱하기 10으로 96웰 플레이트를 시드합니다. 플레이트를 섭씨 37도에서 30-45분 동안 흔들었다가 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소에 18시간 동안 배양합니다. 1x 최적을 사용하여 단층을 세척하십시오. 그런 다음 단일 균주의 HSV로 시드합니다. 한 번에 하나의 균주만 테스트합니다.

플레이트를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소에 3시간 동안 배양합니다. 마그네슘과 칼슘이 함유된 섭씨 37도 PBS 100마이크로리터를 사용하여 감염된 단층을 세척합니다. 그런 다음 섭씨 37도의 HBSS를 사용하여 PBS를 교체합니다. 각 웰에 25마이크로리터의 HBSS를 남겨 둡니다.

다음으로, GT 및/또는 S. aureus 작업 현탁액을 추가하고 플레이트를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소에 30분 동안 배양합니다. 배양 후, 한 번에 한 컬럼씩 플레이트를 흡인합니다. 마그네슘과 칼슘이 포함된 300마이크로리터의 PBS를 사용하여 우물을 즉시 다시 채우십시오.

이 세척 단계를 두 번 반복한 후, 필터 멸균된 RIPA 용해 완충액의 1 내지 50 희석으로 200마이크로리터를 각 웰에 첨가합니다.

다른 박테리아 또는 곰팡이 균주를 사용할 때 사용된 RIPA의 농도가 세포 용해에 충분하지만 미생물 생존력 테스트에는 여전히 허용되는지 확인하십시오.

HeLa 세포 용해물을 빠르게 분쇄하고 50마이크로리터를 만니톨 염 및/또는 살균 배지에 피펫팅합니다. 그런 다음 90도 각도로 구부린 유리 막대를 사용하여 용해물을 플레이트 표면에 펴 바릅니다.

플레이트를 18시간 동안 배양한 후 플레이트당 콜로니 수를 수동으로 계산합니다. 대조군은 S. aureus 및/또는 C. albicans가 HSV에 감염되지 않은 HeLa 세포에 부착하는 것으로 구성됩니다.