JoVE 실험 백과사전
면역학
0 조회수 • 4:23 분 • July 8th, 2025
림프종 세포, 암성 백혈구의 3D 스페로이드 단일 배양, 기저막 매트릭스에서 림프종 및 호중구 유사 세포의 공동 배양을 포함하는 멀티웰 플레이트를 취합니다.
세포내 튜불린에 결합하여 미세소관 중합을 방해하여 세포 사멸을 일으키는 시험 약물을 추가합니다.
공동 배양에서 림프종 세포의 직접적인 접촉은 호중구 유사 세포를 활성화하여 사이토카인 분비를 유도합니다.
이러한 사이토카인은 림프종 세포 수용체와 상호 작용하여 다운스트림 신호 전달 캐스케이드를 유발하고 항세포사멸 단백질 발현을 상향 조절하여 세포 생존을 촉진합니다.
미디어를 버립니다. 세포 접착을 방해하기 위해 해리 완충액을 첨가하십시오.
스페로이드를 긁어내고 교반하면서 배양합니다. 현탁액을 튜브로 옮기고 계속 교반하여 단일 세포 현탁액을 형성합니다.
림프종 및 호중구 유사 세포를 표지하는 형광단 접합 항체 칵테일을 도입합니다.
형광단 태그가 부착된 아넥신 V와 요오드화 프로피듐을 첨가하여 세포사멸 및 죽은 세포를 표지합니다.
유세포 분석을 사용하여 공동 배양에서 림프종 세포 생존율 증가를 감지하여 약물에 대한 호중구 매개 보호를 나타냅니다.
3D 공동 배양을 설정하려면 50,000개의 RL 림프종 B 세포를 단독으로 추가하거나 멸균 15밀리리터 튜브에 HL60 분화 세포와 혼합합니다.
샘플을 회전시키고 개구부가 2-3mm로 절단된 1밀리리터 피펫 팁을 사용하여 펠릿을 300마이크로리터의 기저막 매트릭스에 재현탁합니다. 다음으로, 섭씨 37도 및 5% CO2에서 30분 동안 24웰 플레이트의 각 웰에 있는 300마이크로리터의 세포를 배양합니다.
배양이 끝나면 각 웰에 1밀리리터의 완전 RPMI 배지를 추가하고 2일마다 배지를 교체하면서 7일 동안 인큐베이터에 3D 배양으로 되돌립니다. 5일째에 10나노몰 빈크리스틴을 배양액에 첨가합니다.
배양 1주일 후, 배지를 흡인하고 얼음처럼 차가운 PBS 1밀리리터로 각 웰을 2회 세척합니다. 그런 다음 EDTA가 함유된 얼음처럼 차가운 PBS 3밀리리터를 각 웰에 추가하고 200마이크로리터 피펫 팁으로 웰 바닥을 긁어 젤을 분리합니다. 얼음 위에서 접시를 30분 동안 부드럽게 흔듭니다. 그런 다음 세포 현탁액을 개별 멸균 15밀리리터 튜브로 옮겨 얼음 위에서 30분 동안 부드럽게 흔듭니다.
균질한 세포 현탁액의 모양을 확인합니다. 그런 다음 세포를 회전시킨 다음 PBS 세척을 수행한 다음 FBS와 함께 펠릿을 신선한 PBS에 재현탁합니다. 마지막으로, 방금 시연한 대로 적절한 항체 및 생존율 염료로 세포를 표지하고 그림에 표시된 게이팅 전략을 사용하여 유세포 분석법으로 RL 및 HL60 분화 세포를 분석합니다.